Fréttir

Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Krabbameinsfrumur hafa þróað ýmsar aðferðir til að sigrast á frumustreitu og halda áfram að þróast.Prótein kínasi R (PKR) og próteinvirkjari þess (PACT) eru fyrstu svörunartækin sem fylgjast með ýmsum streitumerkjum sem leiða til hömlunar á frumufjölgun og frumudauða.Hins vegar er stjórnun PACT-PKR ferilsins í krabbameinsfrumum enn að mestu óþekkt.Hér komumst við að því að langur ókóðarandi RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetasa antisense RNA 1 (DARS-AS1) tekur beinan þátt í hömlun PACT-PKR ferlisins og stuðlar að fjölgun krabbameinsfrumna.Með því að nota stórfellda starfræna skimun á CRISPRI 971 krabbameinstengdu lncRNA komumst við að því að DARS-AS1 tengdist verulega aukinni fjölgun krabbameinsfrumna.Þess vegna hindrar DARS-AS1 útsláttur frumufjölgun og ýtir undir frumumyndun krabbameinsfrumna í ýmsum krabbameinsfrumulínum in vitro og dregur verulega úr æxlisvexti in vivo.Vélrænt binst DARS-AS1 beint við PACT virkjunarsvæðið og kemur í veg fyrir PACT-PKR víxlverkun og dregur þar með úr PKR virkjun, eIF2α fosfórun og hamlar apoptótískum frumudauða.Klínískt er DARS-AS1 víða tjáð í mörgum krabbameinum og oftjáning þessa lncRNA er vísbending um slæmar horfur.Þessi rannsókn útskýrir krabbameinssértæka stjórnun á PACT-PKR ferlinum með DARS-AS1 lncRNA og veitir annað markmið fyrir krabbameinshorfur og meðferð.
Hæfni til að laga sig að streitu er mikilvægur eiginleiki fyrir lifun og fjölgun krabbameinsfrumna.Hröð fjölgun og efnaskiptaeinkenni krabbameins ná hámarki í erfiðu örumhverfi - næringarefnaskortur, súrefnisskortur og lágt pH - sem getur kallað fram frumudauðaboðleiðir.Vanstjórnun á streitunæmum genum eins og p535, hitasjokkpróteinum 6, 7, KRAS8, 9 og HIF-110, 11, 12, 13 sést oft í krabbameini, sem hindrar þar með frumuddrun og stuðlar að lifun.
Próteinkínasi R (PKR) er mikilvægur streituskynjari og undireiningarkínasi heilkjörnunga upphafsþáttar 2α (eIF2α), þýðingastillir sem tengir frumuálag við frumudauða.PKR var upphaflega auðkennt sem veirueyðandi prótein með greiningu á erlendu tvíþátta RNA (dsRNA).Við virkjun fosfórar PKR eIF2α til að hindra myndun veiru og frumupróteina14,15,16.PACT (PKR virkjunarprótein) hefur verið skilgreint sem fyrsta PKR virkjunarpróteinið í fjarveru dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Með beinu samspili við PKR umbreytir PACT ýmsum álagi (svelti í sermi, peroxíð eða arsenítmeðferð) til PKR og niðurstreymis boðleiða.Auk eIF2α fosfórunar kveikir PACT-miðluð PKR virkjun á ýmsum atburðum sem tengjast streituviðbrögðum, þar á meðal breyttri redoxstöðu í gegnum PI3K/Akt24 leiðina, aukinni DNA skemmdaskoðun með p5325,26 og NF-κB27,28 stjórnar umritun, 29. Með hliðsjón af mikilvægu hlutverki sínu í streituviðbrögðum, fjölgun, frumudauða og öðrum lykilfrumuferlum, eru PKR og PACT vænleg lækningaleg markmið fyrir marga sjúkdóma, sérstaklega krabbamein30,31,32,33.Hins vegar, þrátt fyrir þessa pleiotropic, virkni og líffræðilega þýðingu, er stjórnun PACT/PKR virkni í krabbameinsfrumum enn fátækleg.
lncRNA eru umrit sem eru stærri en 200 núkleótíð án möguleika á próteinkóðun.Frá því að háþróuð raðgreiningarverkefni í heilu erfðamengi hafa greint þúsundir lncRNAs, 35,36 hefur mikið átak verið gert til að skýra líffræðilega virkni þeirra.Vaxandi fjöldi rannsókna hefur sýnt að lncRNAs taka þátt í mörgum líffræðilegum ferlum37 þar á meðal stjórnun á óvirkjun X-litninga38,39, áprentun40, umritun41,42, þýðingar43 og jafnvel krabbameinsvöxt44,45,46,47.Þessar rannsóknir greindu frá því að mörg lncRNA taka þátt í PACT/PKR ferlinum.Ein slík rannsókn sýndi að lncRNA ASPACT hamlaði PACT umritun og jók kjarna varðveislu PACT mRNA.Aðrar rannsóknir hafa sýnt að lncRNA nc886 binst PKR og hamlar fosfórun þess49,50.Enn sem komið er hefur ekki verið greint frá lncRNA sem stjórnar PACT-miðlaðri PKR virkjun.
Aspartyl-tRNA syntetasi andsense RNA 1 (DARS-AS1) hefur verið auðkennt sem krabbameinsvaldandi lncRNA51,52,53,54.Með stjórnun á miP-194-5p53, miP-12952 og miP-532-3p51 hefur verið sýnt fram á að DARS-AS1 stuðlar að vexti nýrnafrumukrabbameins, skjaldkirtilskrabbameins og lungnakrabbameins sem ekki er af smáfrumugerð.Tong og félagar komust einnig að því að DARS-AS1 stuðlar að framgangi mergæxlis með því að viðhalda stöðugleika prótein 39 (RBM39) RNA-bindandi mótífsins.Hins vegar hafa engar rannsóknir verið gerðar á því hvort þetta lncRNA eigi þátt í stjórnun PACT-PKR virkjunar og streituviðbrögðum krabbameinsfrumna.
Hér gerðum við umfangsmikla skjámynd með því að nota CRISPRI kerfið og komumst að því að DARS-AS1 lncRNA stuðlar að útbreiðslu nokkurra tegunda krabbameinsfrumna.Að auki höfum við greint aðalverkun: DARS-AS1 binst beint við PACT, hindrar PACT og PKR bindingu, kemur í veg fyrir fosfórun á eIF2α, lægra PKR hvarfefni, og hindrar að lokum apoptótísk frumudauða.Að lokum afhjúpar vinna okkar DARS-AS1 lncRNA sem eftirlitsaðila PACT-PKR ferlisins og hugsanlegt markmið fyrir krabbameinsmeðferð og horfur.
Umfangsmiklar rannsóknir á erfðafræðilegum sniðum hafa bent á hundruð lncRNA sem tengjast krabbameini.Hins vegar er hlutverk þeirra að mestu óþekkt56.Til að bera kennsl á efnilega lncRNA frambjóðendur sem taka þátt í framgangi krabbameins, gerðum við skjámynd með tapi á virkni fyrir minni útbreiðslu í SW620 ristilkrabbameinsfrumulínu með því að nota CRISPRi kerfið (mynd 1a).Sérstakur eiginleiki SW480 og SW620 ristilkrabbameinsfrumulína er að þær eru unnar úr frum- og aukaæxlum í einum sjúklingi.Þetta gefur dýrmætan samanburð til að rannsaka erfðafræðilegar breytingar á framvindu langt gengið ristilkrabbameins.Þess vegna greindum við umrit krabbameinsfrumulína í ristli (SW480 og SW620) með því að nota RNA raðgreiningu og söfnuðum nokkrum hugsanlegum virkum lncRNA úr útgefnum bókmenntum.Byggt á þessum niðurstöðum hönnuðum við sameinað sgRNA bókasafn sem innihélt 7355 sgRNA ólígo sem miða á 971 krabbameinstengda lncRNA og 500 ómarkmiða sgRNA oligos fyrir neikvæða stjórn (viðbótargögn 1).
Skýringarmynd af skimun með CRISPRi kerfinu.b sgRNA auðgun eftir skimun.Lárétta punktalínan táknar log2 (faltbreyting) = ±0,58.Lóðrétta punktalínan gefur til kynna p gildi = 0,05.Svartir punktar tákna sgRNA sem ekki er markhópur (tilnefndur NC).Rauðir punktar eru sgRNA sem miða á DARS-AS1.Bláir punktar eru sgRNA sem miða á LINC00205, áður lýst krabbameinsvaldandi lncRNA.fold change = (normalized reading, day 17)/(normalized reading, day 0).c DARS-AS1 sgRNA niðurfelling hamlaði frumuvöxt.Villustikur tákna ± staðalfrávik tilraunanna þriggja.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 tvíhliða t-próf ​​nemenda.d DARS-AS1 tjáning í æxlum (TCGA gagnasafn).em Tjáning DARS-AS1 í pöruðum eðlilegum sýnum og æxlissýnum frá sjúklingum með BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP og COAD, í sömu röð (TCGA gagnasafn).p-gildi voru fengin með því að nota parað tvíhliða t-próf ​​nemenda.
Eftir að hafa smíðað plasmíðið og pakkað lentivírusnum, umbreyttum við dCas9-SW620 ristilkrabbameinsfrumulínuna með ofangreindu safni í fjórum óháðum sýkingartilraunum.Fjöldi sýkinga (MOI) fyrir þessar sýkingar var 0,1–0,3, sem gefur til kynna að hverja frumu sé aðeins hægt að transsýkja með einu sgRNA.Eftir 18 daga in vitro ræktun minnkaði eða jókst auðgunarsnið mark-sgRNAs eftir skimun, á meðan fjöldi ómarkmiðaðra viðmiðunarfákima hélst tiltölulega óbreyttur miðað við forskimunarsniðið, sem gefur til kynna að markið okkar hafi mjög skimunarsérhæft bókasafn.Hrísgrjón.1b og aukatöflu 1). LINC00205, sem áður var tilkynnt um að stuðla að lungnakrabbameini og framvindu lifrarkrabbameins58,59,60, var skimað út (log2 (foldchange) <-0,58, p gildi <0,05), sem staðfestir áreiðanleika þessarar skimunar (mynd 1b). LINC00205, sem áður var tilkynnt um að stuðla að lungnakrabbameini og framvindu lifrarkrabbameins58,59,60, var skimað út (log2 (foldchange) <-0,58, p gildi <0,05), sem staðfestir áreiðanleika þessarar skimunar (mynd 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, sem áður var tilkynnt um að stuðla að framgangi lungnakrabbameins og lifrarkrabbameins58,59,60, var útilokað (log2 (falt breyting) <-0,58, p-gildi <0,05), sem staðfestir styrkleika þessarar skimunar (mynd .1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化））） 变化 该 该 该 该 该 筛选 可靠性 图 图 图 值 值））））。。。 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化））） 变化 该 该 该 该 该 筛选 可靠性 图 图 图 值 值））））。。。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, sem áður var tilkynnt um að stuðla að framgangi lungna- og lifrarkrabbameins58,59,60, var útilokað (log2 (föld breyting) <-0,58, p-gildi <0,05), sem staðfestir styrkleika þessarar skimunar (mynd .1b).
Meðal allra lncRNAs sem prófuð voru, var DARS-AS1 einnig skimað, þar sem þrír tengdir sgRNA fákirni voru verulega lækkuð eftir 18 daga ræktun, sem bendir til þess að niðurfelling þessa lncRNA leiddi til minni krabbameinsfjölgunar (mynd 1b).Þessi niðurstaða var enn frekar studd af MTS greiningu á krabbameinsfrumum í ristli og endaþarmi sem sýndi að vaxtarhraði DARS-AS1 niðurskurðarfrumna minnkaði aðeins um helming samanborið við samanburðarfrumur (Mynd 1c) og var í samræmi við fyrri skýrslur um nokkrar aðrar krabbameinsgerðir.: tærfrumukrabbamein í nýrum, skjaldkirtilskrabbamein og lungnakrabbamein sem ekki er af smáfrumugerð51,52,53,55.Hins vegar er virkni þess og sameindakerfi í ristli og endaþarmi órannsakað.Þess vegna völdum við þetta lncRNA til frekari rannsóknar.
Til að rannsaka DARS-AS1 tjáningu hjá sjúklingum greindum við ítarlega 10.327 æxlissýni úr Cancer Genome Atlas (TCGA) verkefninu.Niðurstöður okkar sýna að DARS-AS1 er víða tjáð og marktækt uppstýrt í heilbrigðum frumum í ýmsum æxlum, þar á meðal ristilkirtilkrabbameini (COAD), tæru nýrnakrabbameini (KIRC) og nýrnapapillarfrumukrabbameini (KIRP)..Mjög fáir (mynd 1d og aukamynd 1a, b). Greining á pöruðum heilbrigðum/æxlissýnum staðfesti enn frekar marktækt meiri tjáningu DARS-AS1 í æxlum þvagblöðruþvagblöðrukrabbameins (BLCA), tært nýrnakrabbameins (KIRC), kirtilkrabbameins í blöðruhálskirtli (PRAD), flöguþekjukrabbameins í lungum (LUSC) , legslímukrabbameini (UCEC), lungnakirtilkrabbameini (LUAD), lifrarfrumukrabbameini (LIHC), nýrnapapillarfrumukrabbameini (KIRP) og kirtilkrabbameini í ristli (COAD) (p gildi < 0,05) (mynd 1e–m) . Greining á pöruðum heilbrigðum/æxlissýnum staðfesti enn frekar marktækt meiri tjáningu DARS-AS1 í æxlum þvagblöðruþvagblöðrukrabbameins (BLCA), tært nýrnakrabbameins (KIRC), kirtilkrabbameins í blöðruhálskirtli (PRAD), flöguþekjukrabbameins í lungum (LUSC) , legslímukrabbameini (UCEC), lungnakirtilkrabbameini (LUAD), lifrarfrumukrabbameini (LIHC), nýrnapapillarfrumukrabbameini (KIRP) og kirtilkrabbameini í ristli (COAD) (p gildi < 0,05) (mynd 1e–m) .Greining á pöruðum heilbrigðum/æxlissýnum staðfesti einnig marktækt meiri tjáningu DARS-AS1 í þvagblöðruþvagblöðrukrabbameini (BLCA), nýrna- og nýrnafrumukrabbameini (KIRC), kirtilkrabbameini í blöðruhálskirtli (PRAD), flöguþekjukrabbameini í lungum (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , legslímukrabbamein í legi (UCEC), kirtilkrabbamein í lungum (LUAD), lifrarfrumukrabbamein í lifur (LIHC), papillary cell carcinoma í nýrum (KIRP) og kirtilkrabbamein í ristli (COAD) (p gildi < 0,05) (Mynd 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 透明 透明 细胞癌 细胞癌 在 在 、 、 前列 前列 腺腺癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 (LUSC) 肿瘤 健康显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （（（（（乳头状 乳头状 细胞癌 （肝肝 细胞癌 （和结肠腺癌 （（（肾 肾 乳头状 乳头状 细胞癌 （（肝肝 细胞癌. <0,05）（图1e-m）.配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 ， ， 内膜 癌 （（（） 肺腺癌 （（（高 肝肝 细胞癌 （（（癌 中 肾 乳头状 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Greining á heilbrigðum/æxlispöruðum sýnum studdi enn frekar hlutverk DARS-AS1 í þvagblöðruþvagblöðrukrabbameini (BLCA), tæru nýrnafrumukrabbameini (KIRC), kirtilkrabbameini í blöðruhálskirtli (PRAD) og flöguþekjukrabbameini í lungum (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). tjáning í leghálskrabbameini (UCEC), lungnakirtilkrabbameini (LUAD), lifrarfrumukrabbameini (LIHC), nýrnapapillarfrumukrabbameini (KIRP) og kirtilkrabbameini í ristli (COAD) (p gildi <0,05) (Mynd 1e -m).Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að DARS-AS1 sé víða og mjög tjáð í ýmsum krabbameinum.
Vegna þess að DARS-AS1 og DARS (genið sem kóðar andskynjunarstrenginn) deila sama hvata og eru staðsettir við hliðina á hvort öðru, hönnuðum við shRNA til að drepa sérstaklega DARS-AS1 en ekki DARS (aukamynd 2a,b og viðbótartafla 2) .Til viðbótar við SW620, notuðum við einnig þrjár aðrar frumulínur sem tjá DARS-AS1 mjög til að rannsaka virkni og virkni shRNA niðurbrots (viðbótartafla 3).Niðurstöður okkar bentu til þess að öll þrjú shRNA sem þróuð voru náðu að minnsta kosti 80% DARS-AS1 knockdown skilvirkni með lítil áhrif á magn DARS mRNA (viðbótar mynd. 2c-f).Að auki komumst við að því að niðurfelling DARS-AS1 með þessum shRNAs hamlaði verulega frumuvöxt í ristilkrabbameinsfrumulínum SW620 (49,7%) og HCT116 (27,7%), brjóstakrabbameinsfrumulínu MBA-MD-231 (53,4%).) og HepG2 lifrarfrumufrumulínu (92,7% minnkun), sem og getu þeirra til að mynda ófestar kúlur (meðalfækkun um ~50,8%, 44,6%, 40,7% og 75,7% á hverja frumulínu) (Mynd 2a,b).Í SW620 staðfestu niðurstöður nýlendumyndunarprófsins enn frekar að DARS-AS1 shRNA hamlaði verulega frumufjölgun með að meðaltali minnkun um það bil 69,6% (mynd 2c).
Áhrif stjórnunar shRNA og DARS-AS1 shRNA á frumufjölgun (a) og kúlumyndun (b) í SW620, HCT116, MBA-MD-231 og HepG2 frumum.c Áhrif stjórnunar shRNA og DARS-AS1 shRNA á nýlendumyndun í SW620 frumum.Frumufjölgun (d), kúlumyndun (e) og nýlendumyndun (f) SW620 frumna sem oftjáa DARS-AS1.Gögn sem sýnd eru eru meðaltal ± staðalfrávik þriggja tilrauna.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 og *** p ≤ 0,001 með tvíhliða t-prófi nemenda.
Til að bæta við rannsóknum á tapi á virkni, bjuggum við næst til SW620 frumur sem oftjáðu DARS-AS1 (viðbótarmynd 2g).DARS-AS1 oftjáning jók marktækt frumuvöxt (1,8-faldan), ófestaðri kúlumyndun (1,4-falt) og nýlendumyndun (3,3-falt) í SW620 frumum (mynd 2d-f).Við staðfestum þessa niðurstöðu með því að nota aðra DARS-AS1 tjáningu frumulínu, A549.Þessi aukna frumufjölgun vegna DARS-AS1 oftjáningar kom enn fram í A549 frumum (aukamynd 2h, i og viðbótartafla 3).Samanlagt sýna þessar ávinnings- og taprannsóknir að DARS-AS1 stuðlar að útbreiðslu krabbameinsfrumna in vitro.
Til að kanna undirliggjandi vélbúnaðinn sem DARS-AS1 stjórnar frumufjölgun, gerðum við RNA niðurfellingargreiningu til að bera kennsl á hugsanlega próteinbindandi samstarfsaðila þess.RT-qPCR niðurstöður sýndu að um 86,2% af DARS-AS1 er staðsett í umfrymi SW620 frumna (viðbótarmynd 3a).In vitro umritaða líftínýleraða DARS-AS1 eða gerviRNA var síðan ræktað með SW620 frumulýsum og fylgt eftir með SDS-PAGE aðskilnaði.Síðari silfurlitun sýndi að sérstakt band (~38 kDa) var marktækt auðgað í DARS-AS1 draga sýnum en ekki í dummy RNA eða perlur sýnum (mynd 3a).Þetta band var auðkennt sem PKR virkjunarprótein (PACT) með massagreiningu (MS) og staðfest frekar með ónæmisblettingu í SW620, HCT116 og HepG2 frumulínum (mynd 3a, b).Auðgun DARS og skyldra PACT próteina – PKR og TRBP – var einnig rannsökuð með RNA greiningu með Western blotting (WB).Niðurstöðurnar bentu til þess að engin bein víxlverkun milli DARS-AS1 RNA og þessara þriggja próteina fannst (viðbótarmynd 3b).Sértæk víxlverkun milli DARS-AS1 og PACT var enn frekar staðfest með RNA ónæmisútfellingu (RIP) greiningu, sem sýndi að DARS-AS1 var marktækt auðgað á and-PACT mótefnum en ekki öðrum samanburðar-RNA (mynd 3c).Til að ákvarða hvort DARS-AS1 hafi bein samskipti við PACT í fjarveru annarra frumuþátta, var in vitro biolayer interferometry (BLI) próf gerð með því að nota hreinsað PACT.Bíótínmerkt DARS-AS1 eða dummy RNA var óhreyft á streptavidin (SA) lífskynjara og síðan ræktað í hreyfijafna sem innihélt 1 μM PACT.Sérstaklega tengdist PACT sterklega við DARS-AS1 (KD gildi ~26,9 nM), en ekki til að líkja eftir RNA (Mynd 3d).Samanlagt sýna þessar niðurstöður bein víxlverkun og mikla sækni milli DARS-AS1 og PACT.
RNA pull greining benti á DARS-AS1 samskipti við PACT í SW620 frumum.Hér að ofan silfurlitun skyldra próteina.Neðri ónæmislotur voru gerðar með and-PACT mótefni.b RNA niðurfellingargreining var gerð í HCT116 (efst) og HepG2 (neðst) frumum.PACT auðgun greindist með ónæmisblettingu.cRNA ónæmisútfellingar (RIP) próf voru gerðar í SW620 frumum með því að nota tilgreind mótefni.d PACT bindingarferlar við DARS-AS1 í fullri lengd eða viðmiðunar-RNA voru fengnar með því að nota líflags interferometry (BLI).RNA var óhreyft á streptavidín lífskynjara.1 μM PACT var notað til að mæla tengsl.e RNA pull prófun var framkvæmd með því að nota biotinylated DARS-AS1 í fullri lengd eða stytt (efst).Immunoblot sem sýnir PACT móttekið (neðst).f Hreinsað flaggað PACT var ræktað með bíótínýleruðu DARS-AS1 í fullri lengd eða stytt (eins og í e) fyrir RIP próf in vitro.Útdregið RNA var staðfest með RT-qPCR.g Hlutfallsleg sækni mismunandi RNA brota fyrir PACT var fengin með því að nota líflags interferometry.Til greiningar voru notuð 100 nM RNA og 1 μM RAST.h In vitro RIP mælingar voru gerðar með því að nota hreinsað ósnortið eða stytt merkt PACT.Útdregið RNA var staðfest með RT-qPCR.i Vaxtarhraði SW620 frumna sem oftjáa DARS-AS1, PACT eða bæði.j Oftjáning á DARS-AS1 í fullri lengd eða styttri í SW620 frumum hafði mismunandi áhrif á frumuvöxt.k Apoptosis greindist með ónæmisblettingu með and-PARP mótefni.l Knockout af DARS-AS1 framkallar frumudauða SW620 frumna eins og sýnt er með frumuflæðismælingu.Gögn sem sýnd eru eru meðaltal ± staðalfrávik þriggja tilrauna. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, með tvíhliða t prófi nemenda. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, með tvíhliða t prófi nemenda. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 með tvíhliða t-prófi nemenda. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 með tvíhliða t-prófi nemenda.
Við mynduðum síðan þrjú líftínýleruð DARS-AS1 RNA brot með in vitro umritun til að bera kennsl á DARS-AS1 svæðið sem þarf fyrir PACT tengsl (mynd 3e).Niðurstöður RNA greiningar sýndu að hvert brot gat haft samskipti við PACT, en 3'-enda svæðið (384-768 kirni merkt A3) sýndi meira en 1-384 kirni merkt A1) (mynd 3e).Svipaðar niðurstöður komu fram í in vitro RIP prófun með því að nota raðbrigða PACT (mynd 3f).Í samræmi við þessar niðurstöður sýndu tilraunir til að binda óhreyfða RNA brot við PACT með BLI einnig að PACT hefur meiri sækni í A3 (384–768 nt) (KD gildi um það bil 94,6 nM), en nánast engin tengsl við önnur svæði.(Mynd 3d).
Við skoðuðum einnig tengda bindisvæði í PACT.PACT inniheldur þrjú virk lén, þar af tvö sem eru varðveitt tvíþátta RNA-bindandi lén (dsRBD) og þriðja lén (nefnt D3) sem virkar sem virkjun próteinsamskipta.Til að kanna lncRNA bindingargetu hvers léns, smíðuðum við þrjár stökkbreytingar sem fjarlægðu hvert af lénunum þremur og gerðum RIP próf in vitro.Niðurstöður okkar sýndu að eyðing á þriðja léninu (D3) af PACT dró verulega úr víxlverkun þess við DARS-AS1 (um 0,11-falt samanborið við ósnortinn PACT) samanborið við hinar tvær stökkbreytingarnar (mynd 3h), sýnt var að losunin af D3 hafði samskipti við DARS.-AC1.Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að samskipti DARS-AS1 og PACT geti átt sér stað fyrst og fremst í gegnum 3′ enda DARS-AS1 og D3 lén PACT.
Við tókum eftir því að DARS-AS1 hafði engin áhrif á PACT tjáningu og PACT hafði engin áhrif á DARS-AS1 (viðbótarmynd 3c).Við skoðuðum síðan áhrif PACT knockdown á frumuvöxt.Öfugt við DARS-AS1, stækkuðu frumur 1,5-3 sinnum hraðar þegar PACT var slegið niður (viðbótarmynd 3d).Niðurstöður nýlendumyndunarprófsins bentu til þess að frumurnar mynduðu 2-3-faldar nýlendur eftir shRNA meðferð með PACT (viðbótarmynd 3e).Til að prófa hvort DARS-AS1 stjórnar frumufjölgun í gegnum PACT, mynduðum við SW620 frumur sem oftjáðu PACT, DARS-AS1 eða bæði.Oftjáning PACT sýndi marktæka hömlun á frumufjölgun (Mynd 3i).Þó að DARS-AS1 oftjáning í sjálfu sér hafi verulega stuðlað að frumufjölgun, var enginn marktækur munur á vaxtarhraða frumna sem oftjáðu DARS-AS1 og PACT.Þessar niðurstöður benda til þess að PACT geti unnið gegn aukinni fjölgun af völdum DARS-AS1 oftjáningar.
Þar sem mismunandi svæði DARS-AS1 hafa mismunandi PACT-bindandi hæfileika, könnuðum við hlutfallsleg áhrif þeirra á frumufjölgun með mismunandi oftjáningu DARS-AS1 brota.Í samanburði við hin tvö brotin var DARS-AS1 oftjáð í 3′ endanum (384-768 nt), helsta PACT-tengt svæði í DARS-AS1, sem hafði hæstu getu til að örva frumufjölgun (mynd 3j).Þessar niðurstöður gefa til kynna jákvæða fylgni á milli bindingargetu og líffræðilegrar virkni DARS-AS1.
Greint hefur verið frá því að PACT sé pro-apoptósískt prótein19.Þess vegna könnuðum við áhrif DARS-AS1 á frumudauða.Eins og við var að búast, jók DARS-AS1 niðurbrot verulega PARP klofning í SW620 frumum og jók hlutfall annexín V-jákvæðra frumna í SW620, HCT116, HepG2 og MBA-MD-231 frumulínum (mynd 3k).3).3f–h), sem gefur til kynna að andstæðingur-apoptotic áhrif DARS-AS1 í krabbameinsfrumum eru andstæðar apoptosis-framkallandi virkni PACT.Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að verkun DARS-AS1 krabbameinsvaldandi virkni gæti verið í gegnum hömlun á PACT virkni.
Næst könnuðum við hagnýtur áhrif DARS-AS1-PACT samtakanna.Greint hefur verið frá því að PACT virkjar PKR með beinni víxlverkun, sem í kjölfarið eykur eIF2α fosfórun, sem veldur þýðingareyðingu og apoptosis17.Í fyrsta lagi skoðuðum við hvort DARS-AS1 hafi áhrif á frumustaðsetningu PACT og PKR.Confocal flúrljómunarsmásjárskoðun sýndi að PACT og PKR voru mjög sambyggð í SW620 frumum með meðal Pearson fylgnistuðul upp á 0,72.Á sama tíma minnkaði DARS-AS1 oftjáning marktækt PACT og PKR samstaðsetningu (meðal Pearson fylgnistuðull 0,61) (Mynd 4a).Til að kanna hvort DARS-AS1 gæti mótað PACT-PKR víxlverkunina gerðum við sam-ónæmisútfellingu (co-IP) próf með and-PACT mótefni í SW620 frumulýsum.PKR var mjög auðgað á and-PACT í samanburðarfrumum, en PKR bati minnkaði verulega í lýsum frá frumum sem oftjáðu DARS-AS1 (mynd 4b).Hreinsuð merkt PACT og PKR voru notuð fyrir in vitro próteinbindingarpróf.Í samræmi við það sýndu þeir sem gáfu DARS-AS1 en ekkert viðmiðunar-RNA bæla PACT-PKR milliverkun (Mynd 4c).Allar niðurstöður sýndu að DARS-AS1 truflaði PACT og PKR samskipti.
Samstaðsetning PACT og PKR í samanburðarfrumum eða frumum sem oftjáðu DARS-AS1 sást með því að nota confocal flúrljómunarsmásjá.Kjarnar voru litaðir með DAPI.Tölfræðilegar niðurstöður fengust úr 16 ljósmyndum.b Samónæmisútfelling (co-IP) með því að nota and-PACT mótefni í frumulýsum SW620 viðmiðunarfrumna eða frumna sem oftjáa DARS-AS1.c Merkt PACT, hreinsað PKR og umritað in vitro með DARS-AS1 eða sýndar-RNA var ræktað til in vitro próteinbindingargreiningar.Fánamótefni voru notuð við ónæmisútfellingu.d Ónæmisblettur með tilgreindum mótefnum voru gerðar í SW620 og HCT116 frumum sem voru transsýktar með viðmiðunar-shRNA eða DARS-AS1-shRNA og fylgt eftir með svelti í sermi.e DARS-AS1 tjáningarstig breyttu frumunæmi fyrir thapsigargini.SW620 frumur voru umbreyttar með DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 oftjáningarplasmíði eða samanburðarplasmíði.Frumur voru meðhöndlaðar með thapsigargini í 48 klukkustundir og lífvænleiki frumna var ákvarðaður með því að nota MTS hvarfefnið.f In vitro umritað DARS-AS1 eða dummy RNA og hreinsað PACT voru notaðir til in vitro virkjunarprófunar og ónæmisblóðgreiningar.g Immunoblots með þessum mótefnum voru gerðar á SW620-ctrl frumum (vinstri) eða frumum sem oftjáðu PKR stökkbrigði (hægri).Þessar frumur voru síðan umbreyttar með viðmiðunar-shRNA eða DARS-AS1-shRNA og fylgt eftir með svelti í sermi.h Flæðifrumumælingar sýndu að óvirkjun á stökkbreytta PKR bætti upp fyrir DARS-AS1 framkallaða frumudauða í SW620 frumum.i Immunoblots með tilgreindum mótefnum voru gerðar í SW620 (vinstri) eða HCT116 (hægri) frumum.Frumur sem eru umbreyttar með stjórn shRNA eða DARS-AS1 shRNA eru sviptar í sermi og bætt við 100 nM PKR C16 hemli eða DMSO.Skalastrik = 5 µm.Gögn sem sýnd eru eru meðaltal ± staðalfrávik þriggja tilrauna.* p ≤ 0,05 tvíhliða t-próf ​​nemenda.
Almennt er talið að þegar PACT hefur samskipti við PKR17, sé hægt að framkalla PKR fosfórun við Thr451.Niðurstöður okkar gáfu til kynna að magn PKR fosfórunar væri marktækt hækkuð í DARS-AS1 knockdown frumum eftir svelti í sermi (mynd 4d og viðbótarmynd 4a).Í samræmi við það komumst við að því að fosfórun eIF2α, aðal PKR hvarfefnisins, var einnig verulega aukin með DARS-AS1 shRNA (mynd 4d og viðbótarmynd 4a).Thapsigargin er ER streituvaldur sem veldur því að ER losar Ca2+.Greint hefur verið frá því að meðferð með thapsigargini framkalli tjáningu og virkjun PACT, sem hefur frekari samskipti við og virkjar PKR, sem leiðir til frumudauða með því að auka eIF2α fosfórun 18,61.Hér notuðum við thapsigargin sem örvun PACT/PKR ferlisins til að kanna hvort DARS-AS1 geti hjálpað frumum að sigrast á streitu með því að hindra PACT/PKR ferilinn.Við sáum að magn DARS-AS1 tjáningar hafði jákvæða fylgni við frumuþol gegn thapsigargini.SW620 frumur sem oftjáðu DARS-AS1 lifðu betur þegar þær voru meðhöndlaðar með thapsigargin, en frumur með DARS-AS1 knockdown urðu næmari (mynd 4e).Í samræmi við þessar niðurstöður dró DARS-AS1 oftjáning úr thapsigargin-völdum PKR fosfórun (viðbótarmynd 4b).Aftur á móti, eftir thapsigargin meðferð, voru PKR og eIF2α fosfórýleruð í meira mæli í DARS-AS1 knockdown frumum samanborið við samanburðarfrumur (viðbótarmynd 4b).Athyglisvert er að thapsigargin framkallaði DARS-AS1 tjáningu á skammtaháðan hátt, sem getur bent til streituvarnarvirkni DARS-AS1 (viðbótarmynd 4c).Að auki gerðum við in vitro virkjunarpróf til að staðfesta þessar athuganir.Í stuttu máli var PKR hreinsað úr frumulýsum með því að nota and-PKR mótefni, síðan ræktað með raðbrigða PACT og DARS-AS1 umritað in vitro.Eftir ensímhvarfið greindist fosfó-PKR með því að nota WB.Niðurstöður okkar gáfu til kynna að PKR fosfórun væri marktækt hamlað af DARS-AS1, en ekki af samanburðar-RNA (Mynd 4f).Þessar in vitro og in vivo niðurstöður benda til þess að DARS-AS1 hamli PACT-miðlaða PKR virkjun.Á sama tíma sáum við einnig lækkun á PACT bata í viðurvist DARS-AS1 (Mynd 4f).Þessi niðurstaða er í samræmi við niðurstöður in vitro próteinbindingarprófsins (Mynd 4c) og sýnir aftur hindrandi virkni DARS-AS1 fyrir PACT-PKR tengsl.
Ser246 og Ser287 í D3 léni PACT eru nauðsynlegar fyrir PKR virkjun undir frumuálagi.Skipting á tveimur serínleifum fyrir alanín gaf stökkbreytt PACT (mutD), sem virkjaði PKR í fjarveru álags, og skipting fyrir alanín (mutA) sneri siðareglunum við.Þar sem við höfum sýnt fram á mikilvægi þessa léns í beinum tengslum við DARS-AS1, mynduðum við þessar tvær PACT stökkbrigði til að prófa hvort þessar leifar gætu einnig tekið þátt í samskiptum við DARS-AS1.Athyglisvert er að báðir stökkbrigðin misstu getu til að bindast DARS-AS1 (aukamynd 4d), sem bendir til þess að fullkomin uppbygging PACT próteins gæti verið nauðsynleg fyrir skilvirka samskipti við DARS-AS1.
Ennfremur benda niðurstöður okkar einnig til þess að DARS-AS1-shRNA-framkallaða hömlun á frumufjölgun sé hægt að endurheimta að hluta með því að oftjáa ríkjandi neikvæða PACT stökkbrigði (PACTmutA) eða ríkjandi neikvæða PKR stökkbrigði (PKRmut) (aukamynd. 4e. e).Oftjáning á ríkjandi-neikvæðum PKR-stökkbreyttum dró úr PKR-fosfórýleringu af völdum DARS-AS1-knúningar sem og eIF2α-fosfórun í sermi-sviptum frumum (mynd 4g).Meira um vert, hlutfall apoptotic frumna framkallað af DARS-AS1 knockdown var einnig minnkað í frumum sem oftjáðu PKRmut (mynd 4h og viðbótarmynd 4g).Hömlun á PKR kínasa virkni skerðir einnig DARS-AS1 virkni, þar sem niðurstöður sýndu að DARS-AS1 rotnun kveikti sjaldan PKR og eIF2α fosfórun þegar frumur voru meðhöndlaðar með PKR sértækum C16 hemli (mynd 4i og viðbótarmynd 4h).).Samanlagt benda niðurstöður okkar til þess að DARS-AS1 stuðli að frumufjölgun, að minnsta kosti að hluta, með því að hindra PACT-miðlaða PKR virkjun.
Til að kanna frekar hlutverk DARS-AS1 í æxlismyndun, gerðum við tilraunir in vivo með því að nota mús xenograft líkan. Niðurstöður sýna að niðurfelling á DARS-AS1 dró verulega úr æxlisvexti í músum (p gildi <0,0001) (mynd 5a). Niðurstöður sýna að niðurfelling á DARS-AS1 dró verulega úr æxlisvexti í músum (p gildi <0,0001) (mynd 5a). Viðskiptaupplýsingar, sem DARS-AS1 eru í boði, eru ekki tilbúnar til notkunar (síða p <0,0001) (5 krónur). Niðurstöðurnar sýna að niðurfelling DARS-AS1 dregur verulega úr æxlisvexti í músum (p gildi < 0,0001) (Mynd 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Viðskiptaupplýsingar, sem DARS-AS1 er notaður, er hægt að nota til að nota (gjald fyrir <0.0001) (5). Niðurstöðurnar sýndu að niðurfelling DARS-AS1 dró verulega úr æxlisvexti í músum (p gildi < 0,0001) (Mynd 5a).Þannig var marktæk minnkun á meðalæxlisrúmmáli í DARS-AS1 hópnum um 72,9% og meðalæxlismassa um 87,8% (mynd 5b-d).Þessar niðurstöður benda eindregið til þess að DARS-AS1 geti verulega stuðlað að æxlisvexti in vivo.
Áhrif af ad DARS-AS1 knockdown á krabbameinsmyndun í ristli í nöktum músum.Vaxtarferlar (a), æxlisstærð (b), þyngd (c) og æxlismyndir (d) eru sýndar.Villustikur tákna ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, með tvíhliða t prófi nemenda. n = 10. ****p < 0,0001, með tvíhliða t prófi nemenda. n = 10. ****p < 0,0001 fyrir gjaldskrá. n = 10. ****p < 0,0001 tvíhliða t-próf ​​nemenda.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 á gjaldeyrisreikningi. ****p < 0,0001 tvíhliða t-próf ​​nemenda.e Kaplan-Meier greindi fylgni milli DARS-AS1 tjáningarstigs og heildarlifunar hjá sjúklingum með UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM og LGG.Mikið magn DARS-AS1 tjáningar hjá sjúklingum var í efstu 50%;lágt stig DARS-AS1 tjáningar hjá sjúklingum var í neðstu 50%.p-gildi voru ákvörðuð með því að nota log rank prófið.f Fyrirhugað líkan þar sem DARS-AS1 stjórnar PACT-PKR ferlinu og æxlisvexti.
Til að skilja betur klínísk áhrif DARS-AS1 skoðuðum við fylgni milli tjáningar þess og lifun sjúklings.Með því að greina TCGA gagnasafnið komumst við að því að hærri DARS-AS1 tjáning tengdist sortuæxli í hálsi (UVM), litningafælni í nýrum (KICH), nýrnapapillarfrumukrabbameini (KIRP), mesóþelíóma (MESO), multiplex.Lægri lifun tengdist marktækt glioblastoma morphosis (GBM) og sjúklingum með lággráðu heila glioma (LGG) (Mynd 5e).Þessar niðurstöður benda til þess að DARS-AS1 gæti gegnt mikilvægu hlutverki í klínískri æxlisframvindu og gæti verið hugsanlegur forspárvísir í mörgum krabbameinum.
Í þessari rannsókn, með því að nota stórfellda CRISPRi starfræna skimun, komumst við að því að DARS-AS1 lncRNA sigrar streitu krabbameinsfrumna með því að stjórna tveimur helstu streituviðbrögðum, PACT og PKR.Með því að hafa bein samskipti við PACT, hindraði DARS-AS1 PACT-miðlaða PKR virkjun og kom þannig í veg fyrir apoptótísk frumudauða og stuðlaði að frumufjölgun (mynd 5f).Uppstjórnun DARS-AS1 hefur sést í mörgum tegundum krabbameins, sem bendir til þess að hlutverk þess að stuðla að lifun krabbameinsfrumna við streituvaldandi aðstæður geti átt við um margar tegundir krabbameins.
PACT hefur verið skilgreint sem PKR virkjunarprótein og PACT-miðluð PKR virkjun gegnir mikilvægu hlutverki í streituviðbrögðum með því að stjórna umritun, þýðingu, frumudauða og öðrum mikilvægum frumuferlum62.Í áratugi hefur verið reynt að skilja krabbameinssértæka reglugerð PACT-PKR fallsins.Hér leiddi rannsókn okkar í ljós mismunandi stjórnunarmáta PACT-PKR í krabbameinsfrumum í gegnum frumu lncRNA DARS-AS1, sem binst beint PACT, hindrar PACT-PKR víxlverkun, hindrar PKR virkjun og eIF2α fosfórun, og hindrar þar með streitu-framkallaða frumudauða og örva endanlega útbreiðslu krabbameins.frumur.Þessi uppgötvun varpar ljósi á hugsanlega lncRNA markmið fyrir krabbameinshorfur og meðferð.
Gögnin okkar sýndu að DARS-AS1 knockdown gerir frumur næmir fyrir svelti í sermi með marktækri aukningu á fosfórýleruðu PKR og eIF2α.Þessar niðurstöður benda til þess að DARS-AS1 stuðli að lifun krabbameinsfrumna við erfiðar aðstæður með því að hindra PACT/PKR virkni.Nokkur önnur RNA sem ekki eru kóðað, eins og ASPACT og nc886, taka einnig þátt í PACT/PKR ásnum með því að minnka PACT48 mRNA eða stjórna sjálffosfórun með því að bindast PKR49,50,64.Þar á meðal virkar DARS-AS1 sem truflun PACT-PKR samtakanna.Þessi rannsókn auðgar skilning okkar á PACT/PKR ásstjórnun og hlutverki lncRNAs í streituviðbrögðum.
PACT inniheldur þrjú aðskilin lén.Hvert af fyrstu tveimur dsRBDs er nægjanlegt til að ná mikilli sæknibindingu PACT við PKR, en þriðja lénið (D3) er nauðsynlegt fyrir PKR virkjun in vitro og in vivo.Rannsókn okkar sýndi að DARS-AS1 hefur helst samskipti við D3 lénið (mynd 3h).Í ljósi stórrar stærðar lncRNA (768 núkleótíð), getur DARS-AS1 binding við D3 líkamlega hindrað víxlverkun milli PACT léns dsRBD og PKR og hindrað þar með tengsl PACT og PKR.PACT punktstökkbreytingar sem skiptu Ser246 og Ser287 í D3 út fyrir alanín eða aspartat trufluðu bindandi sækni þess fyrir DARS-AS1, sem benti á mikilvægi heildarbyggingar- og rafeiginleika D3 í tengslum þeirra.Nánari upplýsingar um þetta fyrirkomulag verða nauðsynlegar í framtíðinni, með því að nota nákvæmari lífefnafræðilega greiningu og PACT byggingargreiningu með mikilli upplausn.
Fyrri rannsóknir hafa greint frá því að DARS-AS1 stuðlar að frumufjölgun með nokkrum aðferðum51,52,53.Í einu dæmi tóku rannsakendur eftir því að DARS-AS1 hækkaði andsense próteinkóða DARS genið með því að miða á miP-194-5p í nýrnakrabbameinsfrumum.Hins vegar, í þessari rannsókn, hafði DARS-AS1 niðurfelling lítil áhrif á DARS umritun í mörgum tegundum krabbameins, þar á meðal að minnsta kosti ristil-, brjósta- og lifrarkrabbamein.Vegna þess að lncRNA sýna frumu- og vefjasértæk tjáningarmynstur, er ekki víst að starfrænir aðferðir haldist í krabbameinstegundum, sem getur stuðlað að þessu misræmi milli athugana okkar og fyrri mats á mismunandi krabbameinum.Sérstakar rannsóknir eru nauðsynlegar til að skýra tiltekna aðferð ýmissa lífeðlisfræðilegra og meinafræðilegra ferla.
Greining á klínískum gögnum sýndi að DARS-AS1 tjáning í æxlum er öfug fylgni við lifun krabbameinssjúklinga, sem undirstrikar mikilvægi DARS-AS1/PACT/PKR ássins í horfum á krabbameini.Að lokum sýnir rannsókn okkar að DARS-AS1 er stjórnandi á PACT/PKR merkjaásnum, stuðlar að útbreiðslu krabbameinsfrumna og hindrar frumudauða meðan á streituviðbrögðum stendur, sem veitir aðra rannsóknarlínu og er áhugavert fyrir framtíðarrannsóknir á hugsanlegum meðferðum. .
Mannafrumulínur SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 og HEK293T voru fengnar frá National Cell Line Resource Infrastructure í Kína.Öllum frumum var haldið í DMEM miðli (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) bætt við 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) og 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) við 37°C, 5% CO2.útungunarvél.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Andstæðingur-PKR (fosfó-T451), Abcam (ab81303);Andfáni, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));and-eIF2α (fosfór S51), Abcam (ab32157);and-PACT (fosfór S246), Abgent (AP7744b);and-β-túbúlín, CST (2128);venjulegt mús IgG, CST (5415S);venjuleg kanína IgG, CST (2729S).Mótefni voru þynnt 1:1000 í PBST fyrir Western blotting og 1:100 fyrir IP.
sgRNA voru þróuð með því að nota opinbert tól sem kallast CRISPR-ERA66.Við notuðum sjálfgefna færibreytur verkfæra fyrir sgRNA þróun og reiknirit reiknaði sgRNA bindisæti á 3 kb svæðinu.miðast við TSS.Söfn af sgRNA fákjörnum voru mynduð hjá CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) og klónuð í manngerð pgRNA plasmíð (Addgene #44248).Alls 12 µg af sameinuðu manngerðu pgRNA plasmíði, 7,2 µg af psPAX2 (Addgene #12260) og 4,8 µg af pMD2.G (Addgene #12259) voru samtransfjótuð í 5 x 106 HEK293T hvarfefni í DNA 10 frumur (CWBIO, Peking, Kína) eftir leiðbeiningum framleiðanda.Veiruinnihaldandi flotefni var safnað 48 og 72 klst. eftir sýkingu og síað í gegnum 0,45 µm síu.Til skimunar voru SW620 frumur sem tjá dCas9/KRAB samrunapróteinið fengnar með veiruflutningi.Breyttar SW620 frumur voru sýktar af veirusafninu í fjórum óháðum sýkingartilraunum við MOI 0,1-0,3 og voru tekin sýni með 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) í 2 daga.Eftir það voru frumur ræktaðar í 18 daga in vitro með lágmarks safnþekju upp á 500 frumur/sgRNA til skimunar.
Erfðafræðilegt DNA var dregið út samkvæmt leiðbeiningum QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Þýskalandi; 51183).Alls voru 100 μg af erfðafræðilegu DNA fyrir hverja líffræðilega endurtekningu notuð til að byggja upp safnið.sgRNA svæðið var magnað upp með tveimur PCR umferðum og tengt strikamerki.
PCR vörur voru hreinsaðar með NucleoSpin® hlaupi og PCR hreinsunarbúnaði (MACHEREY-NAGEL, Düren, Þýskalandi; 740609.250) og magngreindar með Qubit™ HS tvíþátta DNA greiningarsetti (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS prófið var notað til að mæla frumufjölgun.Frumum var sáð í 96-brunn plötur með upphafsþéttleika 2000 frumur/holu.Hlutfallslegur fjöldi frumna var mældur daglega á tilgreindum tíma í samtals 4-6 daga.Fyrir hverja brunn voru 20 μl af MTS hvarfefni (Promega) þynnt með 100 μl af DMEM, ræktað með frumum í 4 klst við 37°C og síðan var OD490 mældur.
Getan til ófestan vaxtar var uppgötvað með því að greina myndun kúlu.Í stuttu máli voru 2000 frumur transsýktar með shRNA DARS-AS1 eða viðmiðunar shRNA ræktaðar í örplötum með ofurlítil viðhengi (Corning) með miðlungs breytingu á 4 daga fresti.Kúlurnar voru taldar eftir 14 daga.500 frumur transsýktar með DARS-AS1 oftjáningarplasmíði eða viðmiðunarplasmíði voru notaðar fyrir aukagreininguna, annars var aðferðin óbreytt.
RNA var umritað með því að nota T7 RNA pólýmerasa og biotin-16-UTP (Roche 1138908910) samkvæmt leiðbeiningum Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Primerarnir sem notaðir eru hér eru taldir upp í viðbótartöflu 4.
Próteinkóða PACT eða PKR svæði voru klónuð inn í pET15b (Addgene #73619) og umbreytt í BL21(DE3).Bakteríurnar voru ræktaðar yfir nótt í LB með ampicillíni og síðan þynnt 100-falt með fersku LB.Þegar OD600 miðilsins náði 0,8 var 1 mM IPTG bætt við til að örva prótein tjáningu.Eftir ræktun yfir nótt með varlega hristingu (250 rpm við 20°C), var frumukúlunni safnað með skilvindu (4000 rpm, 10 mín, 4°C).Endurfleygðu frumukúluna í leysingarjafna (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) og ræktað á ís í 30 mínútur, síðan hljóðlát (15 mín., 5 s á/slökkt, á ís) og skilvindu (13.000) snúninga á mínútu)., 30 mín., 4°С).Fljótandi vökvinn var síðan settur á Ni-NTA plastefni (QIAGEN) 3 sinnum við 4°C, þvegið 4 sinnum með þvottabuffi (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) og skolað 3 sinnum, með samtals af 10 ml skolunarjafnalausn (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazól).Hreinsað prótein var ákvarðað með því að nota WB og styrkurinn var ákvarðaður með Qubit™ próteingreiningarsettinu (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP mælingar voru framkvæmdar eins og áður hefur verið lýst, með breytingum.Í stuttu máli, 1x RIP stuðpúði (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ríbónúkleasahemill (Promega), PMSF (Beyotime líftækni), 1 mM DDM, próteasi) leysir frumueyðandi 1 x 107 kokteil (Roche, 1 mM DTT) og skilið við 13.000 rpm í 15 mínútur við 4 °C.Fljótandi vökvinn var síðan ræktaður með prótein A+G segulperlum (Millipore) tengdar við 5 μg af and-PACT mótefni (Abeam) eða IgG (CST).Perlurnar voru þvegnar 5 sinnum með 5x RIP buffer, síðan meltaðar með próteinasa K (NEB).RNA var dregið út með Trizol og ákvarðað með RT-qPCR.Grunnefni eru sýnd í viðbótartöflu 5.
In vitro RIP prófið var framkvæmt í samræmi við breytta staðlaða RIP prófunaraðferð.Alls 5 pmól af in vitro umrituðu RNA var þynnt 1x með RIP jafnalausn og tengt með ræktun við 65°C í 5 mínútur fylgt eftir með hægum kælingu að stofuhita.Alls voru 5 pmol af ósnortnum eða stökkbreyttum fánamerktum PACT próteinum hreinsuð úr E. coli.Ræktaðu með endurnáttúruðu RNA í 2 klukkustundir við 4°C og fylgdu ofangreindum aðferðum fyrir RIP greiningu fyrir and-fána IP.
Fyrir RNA framlengingargreiningu voru 1×107 frumur ljósaðar með 1xRIP jafnalausn.Eftir skilvindu við 13.000 snúninga á mínútu í 15 mínútur við 4°C var flotið formeðhöndlað með 30 μl af streptavidín segulperlum (Beckman) í 2 klst við 4°C.Hreinsaða lýsatið var síðan útvegað með ger tRNA og ræktað með 40 pmol af endurnáttúruðu RNA yfir nótt við 4°C, síðan í aðrar 2 klukkustundir og 20 μl af nýjum streptavidín segulperlum stíflaðar með BSA var bætt við.Þvottaskrefið samanstóð af 4 sinnum með 5x RIP biðminni og 4 sinnum með 1x RIP jafnalausn.Samsvarandi prótein voru skoluð út með bíótín skolunarbuffi (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-bíótín, PMSF) og aðskilin á NuPAGE 4-12% Bis-Tris hlaupi (Invitrogen).Eftir silfurlitun (Beyotime líftækni) voru ákveðin bönd skorin út og greind með MS.
Co-IP greining var gerð til að prófa samspil PACT og PKR.Í stuttu máli voru lýsöt úr floti útbúin með því að rækta 1 x 107 lýsaðar frumur í 1 x RIP jafnalausn og fylgt eftir með skilvindu við 13.000 rpm í 15 mínútur við 4°C.Lýsöt voru hlaðin prótein A + G segulperlum, samtengd með 5 µg af and-PACT mótefni, og snúið varlega yfir nótt við 4°C.Perlurnar voru þvegnar þrisvar sinnum með 5xRIP jafnalausn, tvisvar með 1xRIP jafnalausn og skolaðar með 1xSDS jafnalausn.Endurheimta próteinið var greint með SDS-PAGE hlaupi og greint með WB.
Tvö pmol af merktu PACT og 1 pmol af PKR voru hreinsuð úr E. coli.Þynntu í 1× RIP jafnalausn og ræktaðu með 10 pmol af endurgerðu RNA í 2 klukkustundir við 4 °C.Eftir það voru þau ræktuð með próteini A+G segulperlu-tengdu andmerktu mótefni í tvær klukkustundir til viðbótar.Perlurnar voru síðan þvegnar fjórum sinnum með 1x RIP jafnalausn og skolaðar með 1x SDS jafnalausn.PACT og PKR sem myndast greindust af WB.