Fréttir

Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Ensímfræðilegar nálægðarmerkingaraðferðir sem byggja á virkum esterum eða fenoxýrótefnum eru mikið notaðar til að kortleggja undirfrumu próteóm og próteinvíxlverkana í lifandi frumum.Hins vegar eru virkjaðir esterar minna hvarfgjarnir, sem leiðir til breiðan merkingarradíus, og fenoxýrótefni sem myndast við peroxíðmeðferð geta truflað redoxferla.Hér greinum við frá nálægðarmerkingarháðri ljósvirkjun (PDPL) aðferð sem þróuð er með erfðafræðilegri tengingu miniSOG ljósnæmandi próteinsins við prótein sem vekur áhuga.Kveikt af bláu ljósi og stjórnað af váhrifatíma, myndast stakt súrefni og síðan er merking histidínleifa með anilínrannsókninni leyst í tíma í tíma.Við sýnum áreiðanleika þess með líffærasértækri próteinkortlagningu.Samanburður hlið við hlið á PDPL við TurboID sýnir sértækari og yfirgripsmeiri próteomic umfjöllun um PDPL.Næst notuðum við PDPL á sjúkdómstengda umritunarvirkjarann ​​BRD4 og E3 Parkin ligasa og fundum áður óþekkta milliverkana.Með oftjáningarskimun voru tvö óþekkt hvarfefni, Ssu72 og SNW1, auðkennd fyrir Parkin, en niðurbrot þess er miðlað af ubiquitination-proteasome ferli.
Nákvæm lýsing á próteinkerfum liggur til grundvallar mörgum grundvallar frumuferlum.Þess vegna mun mjög nákvæm tímabundin kortlagning á próteinvíxlverkunum veita sameindagrundvöll til að ráða líffræðilegar leiðir, meinafræði sjúkdóma og trufla þessar milliverkanir í lækningalegum tilgangi.Í þessu skyni eru aðferðir sem geta greint tímabundnar milliverkanir í lifandi frumum eða vefjum mjög æskilegar.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) hefur í gegnum tíðina verið notað til að bera kennsl á bindifélaga próteina sem vekja áhuga (POI).Með þróun megindlegra próteinfræðiaðferða var Bioplex3.0 búið til, stærsti gagnagrunnur próteinneta byggða á AP-MS.Þrátt fyrir að AP-MS sé mjög öflugt, eru frumugreiningar- og þynningarþrep í verkflæðinu hlutdræg í átt að veikum og tímabundnum bindandi víxlverkunum og kynna gripi eftir lýsu eins og óviðeigandi víxlverkunarpör sem skortir hólfaskiptingu fyrir leysingu.
Til að bregðast við þessum málum hafa verið þróaðar óeðlilegar amínósýrur (UAA) með krossbindandi hópum og ensímmiðunarkerfi (PL) (td APEX og BioID)5.Þrátt fyrir að UAA aðferðin hafi verið beitt með góðum árangri í mörgum tilfellum og veitir upplýsingar um bein prótein lím, er samt þörf á fínstillingu á UAA ísetningarstaðnum.Meira um vert, það er stoichiometric merkingaraðferð sem skortir hvata viðsnúning á merkingaratburðum.Aftur á móti sameina ensímfræðilegar PL-aðferðir, eins og BioID-aðferðin, smíðaða bíótínlígasann við POI7, sem virkjar síðan bíótín til að mynda hvarfgjarnt bíótínýl-AMP ester milliefni.Ensímið hvatar þannig og losar virkt biotín „ský“ sem merkir nærliggjandi lýsínleifar.Hins vegar þarf BioID meira en 12 klukkustundir til að fá nægilegt merkt merki, sem útilokar notkun þess með tímabundinni upplausn.Með því að nota stýrða þróun byggða á gerskjá, var TurboID hannað byggt á BioID til að vera skilvirkara, sem gerir skilvirka merkingu með biotíni innan 10 mínútna, sem gerir kleift að rannsaka kraftmeiri ferla.Vegna þess að TurboID er mjög virk og innrænt bíótínmagn nægir til að merkja á lágu stigi, verður bakgrunnsmerking hugsanlegt vandamál þegar þörf er á mjög aukinni og tímasettri merkingu með því að bæta við utanaðkomandi bíótíni.Að auki eru virkjaðir esterar illa hvarfgir (t1/2 ~5 mín), sem getur leitt til stórs merkingarradíus, sérstaklega eftir mettun nágrannapróteina með bíótíni 5. Í annarri nálgun er erfðafræðilegur samruni vélræns askorbatperoxíðasa (þ.e. bíótín- phenol radicals og leyfa próteinmerkingar innan einnar mínútu9,10.APEX er mikið notað til að bera kennsl á undirfrumu prótein, himnupróteinfléttur og frumuboðspróteinfléttur11,12.Þörfin fyrir háan styrk peroxíða getur hins vegar haft áhrif á redoxprótein eða ferla, truflað frumuferli.
Þannig mun ný aðferð sem er fær um að búa til fleiri hvarfgjarnari merktar radíus bælingartegundir með mikilli staðbundinni nákvæmni og tímabundinni nákvæmni án þess að trufla frumubrautir verulega, mikilvæg viðbót við núverandi aðferðir. Meðal hvarfgjarnra tegunda vakti einblanda súrefni athygli okkar vegna stutts líftíma þess og takmarkaðs dreifingarradíusar (t1/2 < 0,6 µs í frumum)13. Meðal hvarfgjarnra tegunda vakti einblanda súrefni athygli okkar vegna stutts líftíma þess og takmarkaðs dreifingarradíusar (t1/2 < 0,6 µs í frumum)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Meðal virku formanna vakti stakt súrefni athygli okkar vegna stutts líftíma þess og takmarkaðs dreifingarradíusar (t1/2 < 0,6 µs í frumum)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs伕〷 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Meðal virkra forma vekur einblanda súrefni athygli okkar vegna stutts líftíma þess og takmarkaðs dreifingarradíusar (t1/2 < 0,6 μs í frumum).Greint hefur verið frá því að stakt súrefni oxar af handahófi metíónín, týrósín, histidín og tryptófan, sem gerir það skautað 14,15 fyrir viðhengi við amín eða þíól byggt rannsaka16,17.Þrátt fyrir að stakt súrefni hafi verið notað til að merkja undirfrumuhólf RNA, eru aðferðir til að endurnýta innræna POI nálægðarmerki ókannaðar.Hér kynnum við vettvang sem kallast photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), þar sem við notum blátt ljós til að lýsa upp POI sem eru sameinuð með miniSOG ljósnæmandi efni og kveikja á einliða súrefnismyndun til að oxa nærliggjandi leifar, fylgt eftir með breytingum sem innihalda amín til að oxa efnarannsóknir í millilifandi frumur..Við prófuðum hóp efnarannsókna til að hámarka sérhæfni merkja og auðkenndu breytingarstaði með því að nota opið próteomics verkflæði.Samanburður hlið við hlið á PDPL við TurboID sýnir sértækari og yfirgripsmeiri próteomic umfjöllun um PDPL.Við beittum þessari nálgun á frumulíffærasértæka merkja undirfrumu próteómsins og almenna próteómaauðkenningu á bindingaraðilum fyrir krabbameinstengda epigenetic próteinið BRD4 og Parkinsonssjúkdómstengda E3 ligasa Parkin, sem staðfesti bæði þekkt og óþekkt net próteina. samskipti..Hæfni PDPL til að þekkja E3 hvarfefni í stórum próteinfléttum táknar aðstæður þar sem þörf er á að þekkja óbein bindiefni.Tvö óþekkt parkin hvarfefni miðlað af ubiquitination-próteasómi hafa verið staðfest á staðnum.
Ljósaflfræðileg meðferð (PDT)19 og litningahjálpuð leysir óvirkjun (CALI)20, þar sem ljósgeislun með ljósnæmandi efnum myndar einfalt súrefni, getur gert markprótein óvirkt eða valdið frumudauða.Þar sem stakt súrefni er mjög hvarfgjarnt efni með fræðilega dreifingarfjarlægð um 70 nm, er hægt að stjórna staðbundinni oxun í kringum ljósnæmandi efni.Á grundvelli þessarar hugmyndar ákváðum við að nota stakt súrefni til að ná náinni merkingu á próteinfléttum í lifandi frumum.Við höfum þróað PDPL chemoproteomic nálgun til að uppfylla fjórar aðgerðir: (1) að hvata myndun virks singlet súrefnis svipað og PL ensímaðferðin;(2) gefa upp tímabundna merkingu við upphaf ljóss;(3) með breytingu (4) Forðastu að nota innræna samþætti (eins og bíótín) til að draga úr bakgrunni, eða notaðu mjög truflandi utanaðkomandi hvarfefni (eins og peroxíð) til að lágmarka útsetningu frumna fyrir umhverfisálagi.
Hægt er að skipta ljósnæmum í tvo flokka, þar á meðal flúorófóra með litlum mólþunga (td rósabengal, metýlenblátt)22 og erfðafræðilega kóðuð lítil prótein (td miniSOG, KillerRed)23.Til að ná einingahönnun þróuðum við fyrstu kynslóð PDPL vettvangsins með því að bæta ljósnæmandi (PS) próteinum við POI24,25 (Mynd 1a).Þegar það er geislað með bláu ljósi, oxar stakt súrefni nærlægar kjarnasæknar amínósýruleifar, sem leiðir til umpolungrar skautunar sem er rafsækin og getur hvarfast frekar við amínrannsóknarkirni16,17.Neminn er hannaður með alkýnhandfangi til að leyfa smella efnafræði og draga niður fyrir LC/MS/MS einkenni.
Skýringarmynd af merkingu próteinfléttna sem miðlað er af miniSOG.Þegar þær verða fyrir bláu ljósi mynda frumur sem tjá miniSOG-POI stakt súrefni, sem breytir víxlverkandi próteinum en ekki óbindandi próteinum.Milliafurðir ljósoxunar eru stöðvaðar af gengismerkjum amínefnarannsóknarinnar til að mynda samgildar adducts.Alkýnýl hópurinn á efnafræðirannsókninni gerir smellaefnafræði kleift að auðga með því að draga niður og síðan LC-MS/MS magngreiningu.b Efnafræðileg uppbygging amínrannsókna 1-4.c Fulltrúa flúrljómandi hlaupgreining á staðbundnum miniSOG-miðluðum próteómmerkjum í hvatberum með því að nota rannsaka 1-4 og hlutfallslega magngreiningu sem byggist á hlaupþéttnimælingu.Merkja-til-bakgrunnshlutfall efnarannsókna var metið með því að nota neikvæðar samanburðartilraunir sem útiloka blátt ljós eða með því að nota HEK293T frumur án miniSOG tjáningar.n = 2 líffræðilega óháð sýni.Hver punktur táknar líffræðilega eftirmynd.d Fulltrúi uppgötvun og magngreining á PDPL með því að nota bjartsýni rannsakanda 3 í nærveru eða fjarveru tilgreindra PDPL íhluta eins og c.n = 3 líffræðilega óháð sýni.Hver punktur táknar líffræðilega eftirmynd.Miðlínur og hárhönd tákna meðaltal og ± staðalfrávik.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Confocal myndgreining á einblanda súrefni með langt rauðum Si-DMA bletti.Mælikvarðarstöng: 10 µm.Gelmyndataka og confocal tilraunir voru endurteknar sjálfstætt að minnsta kosti tvisvar með svipuðum niðurstöðum.
Við prófuðum fyrst hæfni þroskuðu ljósnæmanna miniSOG26 og KillerRed23, sem eru stöðugt tjáð í HEK293T, til að miðla própargýlamínmerkingu próteómsins sem efnarannsóknar (viðbótarmynd 1a).Gelflúrljómunargreining sýndi að allt próteinmerking náðist með því að nota miniSOG og geislun með bláu ljósi, á meðan engin sýnileg merkingarvara sást með KillerRed.Til að bæta merki-til-bakgrunnshlutfallið prófuðum við síðan sett af efnarannsóknum sem innihéldu anilín (1 og 3), própýlamín (2) eða bensýlamín (4).Við sáum að HEK293T frumur sjálfar höfðu hærra bakgrunnsmerki samanborið við ekkert blátt ljós, mögulega vegna innrænna ríbóflavíns ljósnæmarans, flavín einkirninga (FMN) 27 . Anilín-undirstaða efnarannsókna 1 og 3 gáfu betri sértækni, þar sem HEK293T tjáði miniSOG stöðugt í hvatberum sem sýndi >8-falda aukningu á merkjum fyrir rannsaka 3, en rannsakandi 2 sem notaður var í RNA-merkingaraðferðinni CAP-seq sýndi aðeins ~2,5- falt merki aukningu, líklega vegna mismunandi hvarfgirnivals milli RNA og próteins (mynd 1b, c). Anilín-undirstaða efnarannsókna 1 og 3 gáfu betri sértækni, þar sem HEK293T tjáði miniSOG stöðugt í hvatberum sem sýndi >8-falda aukningu á merkjum fyrir rannsaka 3, en rannsakandi 2 sem notaður var í RNA-merkingaraðferðinni CAP-seq sýndi aðeins ~2,5- falt merki aukningu, líklega vegna mismunandi hvarfgirnivals milli RNA og próteins (mynd 1b, c).Anilín-undirstaða efnarannsókna 1 og 3 sýndu betri sérhæfni: HEK293T, sem tjáir miniSOG stöðugt í hvatberum, sýnir meira en 8-falda aukningu á merkjum fyrir rannsaka 3, en rannsaka 2, notað í CAP-seq RNA merkingaraðferðinni, aðeins sýnir ~2,5-falda aukningu merkja, líklega vegna mismunandi hvarfgirni á milli RNA og próteins (mynd 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用 于 RNA 标记 方法 CAP-seq 的 探针 2 显示 ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilín-undirstaða efnarannsókna 1 og 3 höfðu betri sértækni, HEK293T tjáði miniSOG stöðugt í hvatberum og rannsakandi 3 hafði meira en 8-falda aukningu á merkjum, en rannsakandi 2 fyrir CAP-seq RNA merkingaraðferðina sýndi aðeins ~2,5-falda aukningu.í merkinu, líklega vegna mismunandi hvarfvals milli RNA og próteins (mynd 1b, c).Að auki voru rannsakaðar 3 hverfur og hýdrasínnemar (nemar 5, 6, 7) prófaðar, sem staðfesta hagræðingu rannsakans 3 (viðbótarmynd 1b, c).Á sama hátt leiddi í ljós flúrljómunargreiningu í hlaupi aðrar bjartsýnir tilraunabreytur: geislunarbylgjulengd (460 nm), styrkur efnarannsókna (1 mM) og geislunartími (20 mín) (aukamynd. 2a-c).Að sleppa einhverju íhluti eða skrefi í PDPL samskiptareglunum leiddi til verulegrar viðsnúningar merkisins í bakgrunninn (mynd 1d).Athyglisvert var að próteinmerking minnkaði verulega í nærveru natríumazíðs eða troloxs, sem vitað er að slökkva á stöku súrefni.Tilvist D2O, sem vitað er að kemur stöðugleika á stakt súrefni, eykur merkingarmerkið.Til að kanna framlag annarra hvarfgjarnra súrefnistegunda til merkingar var mannitóli og C-vítamíni bætt við til að koma á hýdroxýl og súperoxíð róteindahreinsiefni, í sömu röð, 18, 29, en þau reyndust ekki draga úr merkingum.Viðbót á H2O2, en ekki lýsing, leiddi ekki til merkingar (aukamynd 3a).Flúrljómun einblanda súrefnismyndataka með Si-DMA rannsaka staðfesti tilvist staks súrefnis í HEK293T-miniSOG vírnum, en ekki í upprunalega HEK293T vírnum.Þar að auki gat mitoSOX Red ekki greint súperoxíðframleiðslu eftir lýsingu (Mynd 1e og viðbótarmynd 3b) 30. Þessar upplýsingar benda eindregið til þess að singlet súrefni sé helsta hvarfgjarna súrefnistegundin sem ber ábyrgð á síðari próteinmerkingu.Frumueiturhrif PDPL voru metin, þ.mt geislun með bláu ljósi og efnarannsóknir, og engin marktæk frumueiturhrif komu fram (viðbótarmynd 4a).
Til þess að rannsaka merkingaraðferðina og gera próteingreiningu á próteinfléttum kleift að nota LC-MS/MS, þurfum við fyrst að ákvarða hvaða amínósýrur eru breyttar og deltamassa rannsakamerkja.Tilkynnt hefur verið um að metíónín, histidín, tryptófan og týrósín breytist með einliða súrefni14,15.Við samþættum TOP-ABPP31 verkflæðið með óhlutdrægri opnu leitinni sem FragPipe tölvuvettvangurinn byggir á MSFragger32.Eftir staka súrefnisbreytingu og merkingu efnarannsókna var smellt efnafræði framkvæmt með því að nota bíótínminnkunarmerki sem innihélt klofnanlegan tengil, fylgt eftir með neutravidín teygju og trypsín melting.Breytta peptíðið, sem enn var bundið við plastefnið, var ljóskljúfað fyrir LC-MS/MS greiningu (Mynd 2a og viðbótargögn 1).Mikill fjöldi breytinga átti sér stað um próteinið með yfir 50 peptíðkortum (PSM) samsvörun skráð (Mynd 2b).Það kemur á óvart að við sáum aðeins breytingar á histidíni, líklega vegna meiri hvarfgirni oxaðs histidíns gagnvart anilínsnörum en öðrum amínósýrum.Samkvæmt útgefnu kerfi histidínoxunar með stöku súrefni,21,33, samsvarar fyrirhuguð delta-massabygging +229 Da efnasambandi rannsakanda 3 með 2-oxó-histidíni eftir tvær oxanir, en +247 Da er vatnsrofsafurðin af +229 Da (aukamynd. 5).Mat á MS2 litrófinu sýndi mikla áreiðanleika auðkenningar flestra y og b jónanna, þar með talið auðkenningu breyttra brotajóna (y og b) (mynd 2c).Samhengisgreining á staðbundinni röð PDPL-breyttra histidína leiddi í ljós hóflegan mótífval fyrir litlar vatnsfælnar leifar í ±1 stöðum (viðbótarmynd 4b).Að meðaltali voru 1,4 histidín auðkennd á hvert prótein og staðsetningar þessara merkja voru ákvarðaðar með leysisaðgengilegu yfirborði (SASA) og hlutfallslegu leysisaðgengi (RSA) greiningu (aukamynd 4c,d).
Óhlutdrægt verkflæði til að rannsaka leifar af sértækni með því að nota FragPipe tölvuvettvanginn knúinn af MSFragger.Klofnanlegir tenglar eru notaðir í Click efnafræði til að leyfa ljósklofnun á breyttum peptíðum úr streptavidin plastefni.Opin leit var sett af stað til að finna fjölmargar breytingar, auk viðeigandi leifar.b Úthlutaðu massa breytinga sem eiga sér stað um próteinið.Peptíð kortlagning PSM.c MS2 litrófsskýring á histidínstöðum breyttum með rannsakanda 3. Sem dæmigert dæmi, samgilt hvarf við rannsakanda 3 bætti +229,0938 Da við breyttu amínósýruna.d Stökkbreytingarpróf notað til að prófa fyrir PDPL merkjum.PRDX3 (H155A, H225A) og PRDX1 (H10A, H81A, H169A) voru umbreytt með villigerð plasmíðum til að greina and-fána.e Tilbúna peptíðið var hvarfað við hreinsað miniSOG í viðurvist rannsaka 3 og samsvarandi afurðir með Δm +247 og +229 komu fram í LC-MS litrófinu.f In vitro prótein-til-prótein víxlverkun gerð með miniSOG-6xHis-merki og and-6xHis mótefni.Sýklalyf (streptavidin-HRP) og Western blot greining gegn músum á miniSOG-6xHis/anti-6xHis mótefnafléttum sem merkt eru með rannsaka 3, allt eftir tíma útsetningar fyrir ljósi.Merkingar fyrir einstök prótein eru gefin upp í samsvarandi mólþunga: LC mótefni létt keðja, HC mótefni þung keðja.Þessar tilraunir voru endurteknar sjálfstætt að minnsta kosti tvisvar með svipuðum niðurstöðum.
Til lífefnafræðilegrar sannprófunar á merkingarstaðnum var PRDX3 og PRDX1, sem auðkennd voru með massagreiningu, breytt úr histidíni í alanín og borið saman við villigerð í transfemingarprófum.PDPL niðurstöður sýndu að stökkbreytingin dró verulega úr merkingu (mynd 2d).Á sama tíma voru peptíðraðirnar sem auðkenndar voru í opnu leitinni tilbúnar og hvarfast in vitro við hreinsað miniSOG í viðurvist rannsaka 3 og blátt ljós, sem skilaði afurðum með massafærslu upp á +247 og +229 Da þegar þær greindar með LC-MS (mynd . 2e).).Til að prófa hvort víxlverkandi nærprótein gæti verið merkt in vitro til að bregðast við miniSOG ljósvirkjun, hönnuðum við gervi nálægðarprófun með víxlverkun milli miniSOG-6xHis próteinsins og and-His einstofna mótefnis in vitro (Mynd 2f).Í þessari greiningu bjuggumst við við nálægri merkingu á þungum og léttum mótefnakeðjum með miniSOG.Reyndar sýndu and-mús (sem þekktu þungar og léttar keðjur af and-6xHis-merktu mótefni) og streptavidin Western blot sterka bíótínýleringu þungu og léttu keðjanna.Athyglisvert tókum við eftir miniSOG sjálfsbíótínýleringu vegna 6xHis merksins og krosstenginga milli léttra og þungra keðja, sem gætu tengst áður lýst bili milli lýsíns og 2-oxó-histidíns aðlægssvörunar.Að lokum komumst við að þeirri niðurstöðu að PDPL breytir histidíni á nálægðarháðan hátt.
Næsta markmið okkar var að einkenna undirfrumu próteinið til að prófa sérhæfni in situ merkingar.Þess vegna tjáðum við miniSOG stöðugt í kjarna, hvatbera fylki eða ytri ER himnu HEK293T frumna (mynd 3a).Gel flúrljómunargreining leiddi í ljós mikið af merktum böndum á þremur undirfrumustöðum sem og mismunandi merkingarmynstri (mynd 3b).Flúrljómunargreining sýndi mikla sérhæfni PDPL (mynd 3c).PDPL vinnuflæðinu var fylgt eftir með smelluviðbrögðum með rhodamine litarefnum til að afmarka undirfrumu prótein með því að nota flúrljómunarsmásjárskoðun og PDPL merki voru sambyggð með DAPI, hvatbera rekja spor einhvers eða ER rekja spor einhvers, sem staðfestir mikla trú PDPL.Fyrir líffærin þrjár, sýndi samanburður hlið við hlið á PDPL við TurboID með því að nota avidin western blot að PDPL var merkt meira sérstaklega samanborið við viðkomandi viðmiðunarhóp.Við PDPL aðstæður birtust fleiri merktar bönd, sem gefa til kynna fleiri PDPL-merkt prótein (viðbótarmynd 6a-d).
skýringarmynd af miniSOG-miðluðum líffærasértækum próteómmerkingum.miniSOG miðar á hvatbera fylkið með samruna við N-enda 23 amínósýrurnar COX4 manna (mito-miniSOG), kjarnann með samruna við H2B (kjarna-miniSOG) og Sec61β um umfrymishlið ER himnunnar (ER-miniSOG) ).Ábendingar eru meðal annars hlaupmyndgreining, confocal myndgreining og massagreiningar.b Fulltrúar hlaupmyndir af þremur líffærasértækum PDPL sniðum.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Fulltrúar samrænar myndir af HEK293T frumum sem tjá miniSOG stöðugt með mismunandi undirfrumustaðsetningum sem greindust með mótefni merktu V5 (rautt).Undirfrumumerki eru notuð fyrir hvatbera og ER (grænt).PDPL vinnuflæðið felur í sér greiningu á miniSOG (gulum) merktum undirfrumu próteómum með því að nota Cy3-azíð smella efnafræði.Mælikvarðarstöng: 10 µm.d Eldfjallauppdrættir af PDPL-merktum próteómum í ýmsum frumum sem eru magngreindir með ómerktri magngreiningu (n = 3 óháðar líffræðilegar tilraunir).Two-tailed Student's t-próf ​​var notað á eldfjallalóðum.HEK293T villigerð var notuð sem neikvæð viðmiðun. Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og >2-faldur jónastyrksmunur). Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og >2-faldur jónastyrksmunur). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og >2-кратная разница в интенсивности ионов). Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og >2-faldur munur á jónastyrk).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og > 2-faldur munur á jónastyrk).Tengd prótein sem eru mikilvæg fyrir HEK293T-miniSOG en ekki mikilvæg fyrir HEK293T eru sýnd með grænu.e Greining á sérhæfni próteómískra gagnasetta úr tilraunum d.Heildarfjöldi tölfræðilega marktækra próteina í hverju frumulíffæri (rauðir og grænir punktar) er merktur efst.Vefrit sýna prótein staðbundin í frumulíffærum byggt á MitoCarta 3.0, GO greiningu og A. Ting o.fl.fólk.Aðskilin gagnasöfn fyrir hvatbera, kjarna og ER.Þessar tilraunir voru endurteknar sjálfstætt að minnsta kosti tvisvar með svipuðum niðurstöðum.Hrágögn eru veitt í formi hrágagnaskráa.
Uppörvandi af niðurstöðum hlaupsins og myndatökunnar var magngreining án merkimiða notuð til að magngreina auðkennt prótein í hverju frumulíffæri (viðbótargögn 2).Óumbreytt HEK293T var notað sem neikvæð viðmiðun til að draga frá bakgrunnsmerkjum. Eldfjallagreining sýndi marktækt auðguð prótein (p < 0,05 og >2-faldur jónastyrkur) sem og eintóna prótein sem eru aðeins til staðar í miniSOG-tjáandi línum (mynd 3d rauðir og grænir punktar). Eldfjallagreining sýndi marktækt auðguð prótein (p < 0,05 og >2-faldur jónastyrkur) sem og eintóna prótein sem eru aðeins til staðar í miniSOG-tjáandi línum (mynd 3d rauðir og grænir punktar). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Eldfjallagreining sýndi marktækt auðguð prótein (p<0,05 og >2-faldur jónastyrkur) sem og stök prótein sem eru aðeins til staðar í miniSOG-tjáandi línum (mynd 3d, rauðir og grænir punktar).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子）） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （3D 红色 和 绿色点）。。。。。。。。。。） 红色 红色 红色 和 绿色点 绿色点火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度）） 仅 存 在于 在于 在于 在于）） 系 的 单一 蛋白质 蛋白质 （图 图 红色 红色 红色 绿色点 。。。 。。。 。。。 和 和 和 （（（（（（ Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Eldfjallagreining leiddi í ljós marktækt auðguð prótein (p<0,05 og >2x jónastyrkur) sem og stök prótein sem eru aðeins til staðar í miniSOG tjáningarlínunni (rauðir og grænir punktar á mynd 3d).Með því að sameina þessi gögn greindum við 1364, 461 og 911 tölfræðilega marktæk kjarna-, hvatbera- og ER ytri himnuprótein, í sömu röð.Til að greina nákvæmni líffæra-staðbundins PDPL notuðum við MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) greiningu og A. Ting o.fl.gagnasett8 var notað fyrir hvatbera, kjarna og ER til að prófa frumulíffærasérhæfni próteina sem fannst, sem samsvarar nákvæmni upp á 73,4, 78,5 og 73,0% (mynd 3e).Sérhæfni PDPL staðfestir að PDPL er tilvalið tæki til að greina líffærasértæk próteóm.Sérstaklega sýndi undirhvatberagreining á auðkenndum hvatberapróteinum að fasta próteinið var aðallega dreift í fylkinu og innri himnunni (226 og 106, í sömu röð), sem er 91,7% (362) af heildarfjölda auðkenndra hvatberapróteina.mikið magn PDPL var auk þess staðfest (viðbótarmynd 7a).Á sama hátt sýndi undirkjarnagreining að fanga próteómið var aðallega dreift í kjarna, kjarna og kjarna (viðbótarmynd 7b).Kjarnapróteingreining með kjarnastaðsetningarmerkjapeptíði (3xNLS) sýndi svipaða nákvæmni og H2B smíðina (aukamynd. 7c-h).Til að ákvarða sérhæfni PDPL merkisins var kjarna laminín A valið sem staðbundnari POI7 gildra.PDPL greindi 36 marktækt auðguð prótein, þar af 12 prótein (30,0% að meðtöldum lamin A) voru vel einkennd lamin A víxlverkandi prótein með athugasemdum af String gagnagrunninum, með hærra hlutfalli en BioID aðferðin (122 prótein) 28 af 28. , 22,9 %) 7. Aðferð okkar greindi færri prótein, mögulega vegna takmarkaðra merkingarsvæða, sem var gert mögulegt með virkara einblanda súrefni.GO greining sýndi að auðkennd prótein voru aðallega staðsett í kjarnahimnu (26), kjarnahimnu (10), kjarnahimnu (9) og kjarnaholum (5).Samanlagt voru þessi kjarnastaðsettu prótein reikningur fyrir 80% af auðguðu próteinum, sem sýnir frekar sérhæfni PDPL (aukamynd. 8a-d).
Eftir að hafa staðfest getu PDPL til að framkvæma nálægðarmerkingar í frumulíffærum, prófuðum við síðan hvort hægt væri að nota PDPL til að greina POI bindandi samstarfsaðila.Sérstaklega var leitast við að skilgreina PDPL greiningu á frumudrepróteinum, sem eru talin erfiðari markmið en hliðstæður þeirra sem eru staðsettar í himnu, vegna mjög kraftmikils eðlis þeirra.Bromodomain and extraterminal (BET) próteinið BRD4 hefur vakið athygli okkar fyrir lykilhlutverk sitt í ýmsum sjúkdómum 35, 36 .Fléttan sem myndast af BRD4 er umritunarvirkjari og mikilvægt meðferðarmarkmið.Með því að stjórna tjáningu c-myc og Wnt5a umritunarþátta er talið að BRD4 sé lykilákvörðunarvald bráðu mergæxlis (AML), mergæxlis, Burkitt eitilæxli, ristilkrabbameins og bólgusjúkdóma37,38.Að auki miða sumar vírusar á BRD4 til að stjórna veiru- og frumuumritun, svo sem papillomavirus, HIV og SARS-CoV-236,39.
Til að kortleggja BRD4 samspilið með því að nota PDPL sameinuðum við miniSOG með stuttu N- eða C-enda ísóformi BRD4.Proteomic niðurstöður leiddu í ljós mikla skörun milli bygginganna tveggja (aukamynd 9a).Kjarnapróteinið sem er auðkennt með miniSOG-H2B þekur 77,6% af próteinum sem hafa samskipti við BRD4 (aukamynd 9b).Síðan voru mismunandi lýsingartímar (2, 5, 10, 20 mín) notaðir til að stilla radíus merkisins (mynd 4a og viðbótargögn 3).Við komumst að þeirri niðurstöðu að á styttri ljósatímabilum mun PDPL fyrst og fremst merkja bein bindiefni, en lengri tímabil innihalda prótein sem auðkennd eru á styttri ljósvirkjunartímabilum sem og óbein markmið í merkingarfléttum.Reyndar fundum við mikla skörun á milli aðliggjandi tímapunkta (84,6% í 2 og 5 mínútur; 87,7% í 5 og 10 mínútur; 98,7% í 10 og 20 mínútur) (Mynd 4b og viðbótarmynd 9c).Í öllum tilraunahópum fundum við ekki aðeins BRD4 sjálfsmerkingu, heldur nokkur þekkt skotmörk eins og MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A og HMGB1 merkt í strengjagagnagrunninum.Jónastyrkur þessara marka er í réttu hlutfalli við útsetningartímann (mynd 4c og aukamynd 9d).GO greining á próteinum sem auðkennd voru í 2 mínútna hópnum sýndi að auðkennd prótein voru staðbundin í kjarnanum og tóku þátt í endurgerð litninga og virkni RNA pólýmerasa.Sameindavirkni próteinsins var auðgað í litningabindingu eða umritunarsamvirkni, í samræmi við virkni BRD4 (mynd 4d).Strengjagagnagrunnsvirkt próteinvíxlverkunargreining leiddi í ljós fyrsta stig óbeinna víxlverkana milli BRD4 og HDAC fjölskyldu víxlverkandi fléttna eins og SIN3A, NCOR2, BCOR og SAP130 (mynd 4e og viðbótarmynd 9e), í samræmi við BRD4 og HDAC bindandi asetýleruð histón ..Að auki voru dæmigerð markmið sem greind voru með LC-MS/MS, þar á meðal Sin3A, NSUN2, Fus og SFPQ, staðfest með Western blotting (mynd 4f).Nýlega hefur verið greint frá því að stutt ísóform BRD4 myndar kjarna með vökva-vökvafasa aðskilnað (LLPS) eiginleika.RNA bindipróteinin Fus og SFPQ miðla LLPS ýmissa frumuferla og hafa verið auðkennd hér sem óskráð BRD4 bindiprótein.Samspilið á milli BRD4 og SFPQ var staðfest með sam-ónæmisútfellingu (co-IP) tilraunum (Mynd 4g), sem bendir til annars kerfis fyrir BRD4-miðlaðan vökva-vökva fasa aðskilnað sem verðskuldar frekari rannsókn.Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að PDPL sé kjörinn vettvangur til að bera kennsl á þekkt BRD4 samskipti sem og óþekkt bindiprótein.
skýringarmynd af miniSOG-miðluðum BRD4 nálægðarmerkingum, lýsingartímar: 2, 5, 10 og 20 mín.b Skörun próteina sem greind eru á mismunandi lýsingartíma.Próteinauðgun sem greind var í HEK293T-miniSOG-BRD4 var tölfræðilega marktæk samanborið við villigerð HEK293T.c Jónastyrkur þegar magngreining er ómerkt dæmigerð þekkt BRD4-bindandi prótein á tilgreindum útsetningartíma.n = 3 líffræðilega óháð sýni.Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik.d Genaverufræðileg greining (GO) á próteinum sem greind eru í 2 mínútna hópnum.Fyrstu tíu GO hugtökin eru skráð.Bólur eru litaðar í samræmi við GO hugtakaflokkinn og kúlastærð er í réttu hlutfalli við fjölda próteina sem finnast í hverju orði.e Strengjagreining á próteinum sem hafa samskipti við BRD4.Gulu hringirnir eru beint lím og gráu hringirnir eru fyrsta lagið af óbeinu líminu.Rauðu línurnar tákna víxlverkanir sem ákvarðaðar eru í tilraunaskyni og bláu línurnar tákna víxlverkanir sem spáð er fyrir um.f Fulltrúa BRD4 bindandi markmið sem auðkennd voru í LC-MS/MS voru staðfest með Western blotting.g Samhliða ónæmisútfellingartilraunir staðfesta víxlverkun SFPQ og BRD4.Þessar tilraunir voru endurteknar sjálfstætt að minnsta kosti tvisvar með svipuðum niðurstöðum.Hrágögn eru veitt í formi hrágagnaskráa.
Auk þess að bera kennsl á óskráð POI-tengd markmið, gerum við tilgátu um að PDPL henti til að bera kennsl á hvarfefni fyrir ensím, sem myndi krefjast þess að einkenna óbein bindiprótein í stórum fléttum til að gera athugasemdir við óskráð hvarfefni.Parkín (kóðuð af PARK2) er E3 lígasi og stökkbreytingar í parkíni eru þekktar fyrir að valda sjálfsfrumna víkjandi ungum Parkinsonsveiki (AR-JP)42.Að auki hefur parkín verið lýst sem nauðsynlegt fyrir hvatbera (mitochondrial autophagy) og fjarlægingu hvarfgjarnra súrefnistegunda.Hins vegar, þó að nokkur parkín hvarfefni hafi verið auðkennd, er hlutverk parkins í þessum sjúkdómi enn óljóst.Til að gera athugasemdir við óeinkennandi hvarfefni þess var PDPL prófað með því að bæta miniSOG við N- eða C-enda parkíns.Frumur voru meðhöndlaðar með karbónýlsýaníð róteindaflutningsefninu m-klórfenýlhýdrasóni (CCCP) til að virkja parkín í gegnum PINK1-Parkin leiðina.Samanborið við BRD4 PDPL niðurstöður okkar leiddi samruni parkins N-enda í ljós stærra mengi markpróteina, þó að það náði yfir stærri hluta C-enda (177 af 210) (Mynd 5a,b og viðbótargögn 4).Niðurstaðan er í samræmi við skýrslur um að N-terminal merki geti afbrigðilega virkjað Parkin44.Það kemur á óvart að það voru aðeins 18 prótein sem skarast í gögnum okkar með birtum AP-MS niðurstöðum fyrir Parkin43, líklega vegna mismunar milli frumulína og próteomics vinnuflæðis.Auk fjögurra þekktra próteina (ARDM1, HSPA8, PSMD14 og PSMC3) auðkennd með tveimur aðferðum (mynd 5c)43.Til að sannreyna frekar niðurstöður LC-MS/MS var PDPL meðferð og síðari Western blotting notuð til að bera saman niðurstöður HEK293T foreldrafrumugreiningarinnar og stöðugu N-enda parkínlínunnar.Áður óþekkt markmið CDK2, DUT, CTBP1 og PSMC4 voru prófuð með þekktu bindiefni, DNAJB1 (mynd 5d).
Eldfjallauppdráttur af próteinum sem víxlverkandi parkín í HEK293T frumum með stöðugt tjáð miniSOG sameinað N- eða C-enda parkins (n ​​= 3 óháðar líffræðilegar tilraunir).Two-tailed Student's t-próf ​​var notað á eldfjallalóðum.HEK293T var notað sem neikvæð viðmiðun. Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og >2-faldur jónastyrksmunur). Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og >2-faldur jónastyrksmunur). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og >2-кратная разница в интенсивности ионов). Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og >2-faldur munur á jónastyrk).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Marktækt breytt prótein eru auðkennd með rauðu (p < 0,05 og > 2-faldur munur á jónastyrk).Tengd prótein sem eru mikilvæg fyrir HEK293T-miniSOG en ekki mikilvæg fyrir HEK293T eru sýnd með grænu.b Venn skýringarmynd sem sýnir prótein sem skarast á milli N-enda og C-enda byggingar.N-enda merki geta afbrigðilega virkjað parkín og leitt til auðþekkjanlegra próteina.c Venn skýringarmynd sem sýnir prótein sem skarast á milli PDPL og AP-MS.Þekktir gagnvirkar eru taldir upp, þar á meðal 4 af 18 próteinum sem skarast og 11 af 159 próteinum sem eru sérstaklega auðkennd í PDPL.d Dæmigert markmið sem auðkennd voru með LC-MS/MS voru staðfest með Western blotting.e Ssu72 og SNW1 voru auðkennd sem óskráð parkin hvarfefni.Þessi FLAG-merktu próteinplasmíð voru umbreytt í HEK293T og HEK293T-Parkin-miniSOG og fylgt eftir með CCCP meðferð á ýmsum tímapunktum.Niðurbrotið var meira áberandi í Parkin oftjáningarlínunni.f Með því að nota próteasómhemilinn MG132 var staðfest að niðurbrotsferlið Ssu72 og SNW1 er miðlað með próteasóm-ubiquitination.Þessar tilraunir voru endurteknar sjálfstætt að minnsta kosti tvisvar með svipuðum niðurstöðum.Hrágögn eru veitt í formi hrágagnaskráa.
Sérstaklega verða próteinin sem auðkennd eru með PDPL að innihalda parkínbindandi prótein og hvarfefni þeirra.Til að greina óskráð parkín hvarfefni völdum við sjö auðkennd prótein (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 og SNW1) og umbreytt plasmíð til að afhjúpa þessi gen fyrir eðlilegu HEK293T og tjá stöðugt miniSOG-Parkin's meðferð fylgt eftir með HEK293T.Magn Ssu72 og SNW1 próteina minnkaði verulega í stöðugu miniSOG-Parkin línunni (mynd 5e).Meðferð með CCCP í 12 klukkustundir leiddi til marktækasta niðurbrots beggja hvarfefna.Til að kanna hvort niðurbrot Ssu72 og SNW1 sé stjórnað með próteasóm-ubiquitination, var próteasómhemlinum MG132 bætt við til að hamla virkni próteasóms og í raun komumst við að því að niðurbrotsferli þeirra var hamlað (mynd 5f).Viðbótarmarkmið sem ekki eru hvarfefni voru staðfest sem Parkin milliverkanir með því að nota Western blotting (viðbótarmynd 10), sem sýndi samkvæmar niðurstöður með LC-MS/MS.Að lokum gerir samþætting PDPL vinnuflæðis við sannprófun markpróteinsflutnings kleift að bera kennsl á óskráð E3 lígasa hvarfefni.
Við höfum þróað sameiginlegan vettvang fyrir nálægðarmerkingar sem gerir þér kleift að bera kennsl á áhugaverða staði í tíma og rúmi.Vettvangurinn er byggður á miniSOG ljósnæmandi próteininu, sem er aðeins um 12 kDa, minna en helmingi stærri en þroskaða APEX2 ensímið (27 kDa) og þriðjungur á stærð við TurboID (35 kDa).Minni stærðin ætti að auka verulega notkunarsvið til að rannsaka lítil próteinvíxlverkun.Frekari könnun á viðbótar ljósnæmandi efnum, hvort sem er erfðafræðilega kóðuð prótein eða litlar sameindir, er þörf til að auka skammtaafrakstur einstaks súrefnis og auka næmni þessarar aðferðar.Fyrir núverandi útgáfu af miniSOG er hægt að ná háum tímaupplausn með því að nota bláa lýsingu til að virkja nálægðarmerki.Þar að auki losaði lengri útsetningartími stærra „ský“ af stöku súrefni, sem leiddi til breytinga á fjarlægari histidínleifum, aukinni merkingarradíus og getu til að fínstilla PDPL staðbundna upplausn.Við prófuðum einnig sjö efnarannsókna til að auka merki-til-bakgrunnshlutfallið og könnuðum sameindakerfið á bak við þessa nálgun.TOP-ABPP vinnuflæðið ásamt óhlutdrægri opinni leit staðfesti að breytingar áttu sér aðeins stað í histidínum og ekkert stöðugt örumhverfi sást fyrir auknar histidínbreytingar, nema í meðallagi val á histidínum á lykkjusvæðinu.
PDPL hefur einnig verið notað til að einkenna undirfrumu próteóm með sérhæfni próteóma og þekju sem er að minnsta kosti sambærileg við aðrar nálægðarmerkingar og frumulíffærasértækar efnarannsóknaaðferðir.Nálægðarmerki hafa einnig verið notuð með góðum árangri til að einkenna yfirborðs-, ljósósóma- og seytu-tengd próteóm46,47.Við teljum að PDPL muni vera samhæft við þessi undirfrumulíffæri.Að auki ögruðum við PDPL með því að bera kennsl á markmið fyrir umfrymispróteinbindingu sem eru flóknari en himnubundin prótein vegna kraftmikilla eiginleika þeirra og þátttöku í tímabundinni samskiptum.PDPL var borið á tvö prótein, umritunarvirkjarann ​​BRD4 og sjúkdómstengda ligasa E3 Parkin.Þessi tvö prótein voru valin ekki aðeins vegna grundvallar líffræðilegra virkni þeirra, heldur einnig vegna klínísks mikilvægis þeirra og lækningamöguleika.Fyrir þessar tvær POI voru þekktir bindandi samstarfsaðilar sem og óskráð skotmörk auðkennd.Athyglisvert var að fasaaðskilnaðartengd prótein SFPQ var staðfest með co-IP, sem gæti bent til nýs kerfis þar sem BRD4 (stutt ísóform) stjórnar LLPS.Á sama tíma teljum við að auðkenning á Parkin hvarfefnum sé atburðarás þar sem nauðsynlegt er að bera kennsl á óbein lím.Við greindum tvö óþekkt parkin hvarfefni og staðfestum niðurbrot þeirra meðfram ubiquitination-proteasome ferlinum.Nýlega hefur verið þróuð aðferð sem byggir á vélbúnaði til að greina hýdrólasa hvarfefni með því að fanga þau með ensímum.Þrátt fyrir að þetta sé mjög öflug aðferð hentar hún ekki til greiningar á hvarfefnum sem taka þátt í myndun stórra fléttna og krefst þess að mynda samgild tengsl milli ensímsins og hvarfefnisins.Við gerum ráð fyrir að hægt sé að útvíkka PDPL til að rannsaka önnur próteinfléttur og ensímfjölskyldur, svo sem deubiquitinase og metalloproteasa fjölskyldurnar.
Nýtt form af miniSOG, sem kallast SOPP3, hefur verið þróað með bættri stöku súrefnisframleiðslu.Við bárum saman miniSOG við SOPP3 og fundum betri merkingarafköst, þó að hlutfall merki til hávaða haldist óbreytt (aukamynd 11).Við gerðum þá tilgátu að hagræðing á SOPP3 (td með stýrðri þróun) myndi leiða til skilvirkari ljósnæmandi próteina sem krefjast styttri ljóstíma og gera þannig kleift að fanga kraftmeiri frumuferli.Athyglisvert er að núverandi útgáfa af PDPL er takmörkuð við frumuumhverfið þar sem það krefst lýsingar á bláu ljósi og getur ekki farið í gegnum djúpa vefi.Þessi eiginleiki útilokar notkun þess í dýralíkanarannsóknum.Hins vegar gæti samsetning optogenetics og PDPL veitt tækifæri til rannsókna á dýrum, sérstaklega í heilanum.Að auki fjarlægja aðrir hannaðir innrauðir ljósnæmir einnig þessa takmörkun.Rannsóknir standa nú yfir á þessu sviði.
HEK293T frumulínan var fengin frá ATCC (CRL-3216).Frumulínan reyndist neikvæð fyrir mycoplasma sýkingu og var ræktuð í DMEM (Thermo, #C11995500BT) ásamt 10% fóstursermi (FBS, Vistech, #SE100-B) og 1% penicillín/streptomycin (Hyclone, #SV30010).vaxið í.
3-Amínófenýlen (sýni 3) og (4-etýnýlfenýl)metanamín (sýni 4) voru keypt frá Bidepharm.Própýlamín (kanna 2) var keypt frá Energy-chemicals.N-(2-Amínófenýl)pent-4-ynamíð (soni 1) var búið til samkvæmt birtum aðferðum.
Viðbótartafla 1 sýnir erfðafræðilegar byggingar sem notaðar eru í þessari rannsókn.MiniSOG og KillerRed röðin voru klónuð úr gjafaplasmíði frá P. Zou (Peking University).Hvatbera fylkismiðunarröðin var fengin úr 23 N-enda amínósýrum COX4 og klónuð inn í tilgreindar ferjur með því að nota Gibson samsetningu (Beyotime, #D7010S).Til að miða á himnu og kjarna endoplasmic reticulum, SEC61B manna DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) magnað með PCR úr cDNA safni HEK293T frumna, og H2B DNA (gefin af D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) og klónað, eins og nefnt er hér að ofan.Nema annað sé tekið fram, voru önnur próteingen sem notuð voru við transfection og byggingu stöðugra frumulína PCR mögnuð úr HEK293T frumu cDNA safninu.G3S (GGGS) og G4S (GGGGS) voru notuð sem tengir á milli beitupróteinsins og miniSOG.V5 epitope tag (GKPIPNPLLGLDST) var bætt við þessar samruna smíðar.Til tjáningar í spendýrum og til að koma á stöðugri frumulínu var miniSOG samrunabyggingin undirklónuð inn í pLX304 lentiveiruferjuna.Fyrir tjáningu baktería var miniSOG klónað inn í pET21a ferjuna merkt 6xHis í C-endanum.
HEK293T frumur voru sáð með 2,0 x 105 frumum í hverri brunn í sex-brunna plötum og transsýktar 24 tímum síðar með raðbrigðum lentiveiru plasmíðum (2,4 μg pLX304) og veiru umbúða plasmíðum (1,5 μg psPAX2 og 1,2 μg psPAX2 og 1,2 μg með Lipo2 . , #C0533), um 80% samruna.Eftir flutning yfir nótt var skipt um miðil og ræktað í aðra 24 klukkustundir.Söfnun veirunnar fór fram eftir 24, 48 og 72 klst.Fyrir sýkingu á markfrumulínum var veirumiðillinn síaður í gegnum 0,8 μm síu (Merck, #millex-GP) og polybrene (Solarbio, #H8761) var bætt við í styrkleikanum 8 μg/ml.Eftir 24 klukkustundir var frumunum leyft að jafna sig með því að skipta um miðil.Frumur voru valdar með því að nota 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) fyrir fyrstu þrjár göngurnar sem lægra strangt val.Notaði síðan 20 μg/ml sem strangari meðferð í næstu þremur göngum.
Frumum var sáð í 12-brunn hólf (Ibidi, #81201) með þéttleika sem var um það bil 20.000 frumur í hverri holu.Til að bæta viðloðun HEK293T frumna, bætið við 50 µg/ml fíbrónektíni (Corning, #356008) þynnt í fosfatbuðrað saltvatni (PBS, Sangon, #B640435) við 37°C.Hólfin voru formeðhöndluð í 1 klukkustund og síðan fjarlægð með PBS.Eftir 24 klst. voru frumur þvegnar einu sinni með PBS, ræktaðar með 1 mM rannsaka 3 í ferskum Hanks' jafnvægissaltlausn (HBSS, Gibco, #14025092) í 1 klst við 37°C, og síðan ræktaðar með bláu LED (460 nm) ).) voru geislaðir í 10 mínútur við stofuhita.Eftir það voru frumurnar þvegnar tvisvar með PBS og festar með 4% formaldehýði í PBS (Sangon, #E672002) í 15 mínútur við stofuhita.Umfram formaldehýð var fjarlægt úr föstum frumum með því að þvo þrisvar með PBS.Frumur voru síðan gerðar gegndræpar með 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) í PBS og þvegnar þrisvar sinnum með PBS.Fjarlægðu síðan hólfið og bættu við hvert sýni 25 µl af smelluhvarfablöndu sem inniheldur 50 µM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) og 0,5 mg/ml natríumaskorbat (Aladdin, nr. S105024) og ræktað í 30 mínútur við stofuhita.Eftir skyndiviðbrögð voru frumur þvegnar sex sinnum með PBS sem innihélt 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) og síðan lokað með 5% BSA (Abcone, #B24726) í PBST í 30 mínútur við stofuhita.
Fyrir ónæmislitun á frumum voru frumur ræktaðar með frummótefnum í samræmi við tilgreind skilyrði: mAb and-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), kanína and-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), kanínu fjölstofna and-calnexin mótefni (1:500, Abcam, #ab22595) eða kanínu and-lamin A/C einstofna mótefni (1:500; CST, #2032) við 4 °C yfir nótt.Eftir þvott 3 sinnum með PBST, voru frumur ræktaðar með aukamótefnum: geit gegn kanínu Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) þynnt 1:1000, geit gegn mús Alexa Fluor 594 (CST, #8889) þynnt 1:1000.þynning Þynnið við stofuhita í 30 mínútur.Frumur voru síðan þvegnar þrisvar sinnum með PBST og mótlitaðar með DAPI (Thermo, #D1306) í PBS í 10 mínútur við stofuhita.Eftir 3 þvott með PBS voru frumur innsiglaðar í 50% glýseróli (Sangon, #A600232) í PBS til myndatöku.Ónæmisflúrljómandi myndir voru fengnar með því að nota ZEISS LSM 900 Airyscan2 samræna smásjá og ZNE 3.5 hugbúnað.
Fyrir einblanda súrefnisflúrljómun voru frumur þvegnar tvisvar með Hanks HEPES jafnalausn áður en 100 nM Si-DMA var bætt við í Hanks HEPES jafnalausn (DOJINDO, #MT05).Eftir útsetningu fyrir ljósi voru frumurnar ræktaðar í CO2 útungunarvél við 37°C í 45 mínútur.Frumur voru síðan þvegnar tvisvar með Hanks' HEPES buffer og mótlitaðar með Hoechst í Hanks' HEPES buffer í 10 mínútur við stofuhita og sýndar með ZEISS LSM 900 confocal smásjá., #M36008) í HBSS jafnalausn sem inniheldur kalsíum og magnesíum.Eftir útsetningu fyrir ljósi eða doxórúbisíni (MCE, #HY-15142A), voru frumur ræktaðar í CO2 útungunarvél við 37°C í 10 mínútur, þvegnar tvisvar með HBSS jafnalausn og ræktaðar með Hoechst í HBSS jafnalausn við stofuhita.mínútur.Doxórúbicín var notað sem jákvætt rannsóknarpróf þar sem frumur voru meðhöndlaðar með 20 μM doxórúbicíni í HBSS sem innihélt 1% BSA í 30 mín.Ónæmisflúrljómandi myndir voru fengnar með Zeiss LSM 900 confocal smásjá.
HEK293T frumur sem tjá mító-miniSOG stöðugt voru sáð með þéttleika um það bil 30% í 15 cm diskum.Eftir 48 klukkustundir, þegar ~80% samruna var náð, voru frumurnar þvegnar einu sinni með PBS, ræktaðar með 1 mM Probe 3 í ferskum HBSS buffer í 1 klukkustund við 37°C og síðan lýst upp með bláum LED í 10 mínútur í herberginu. hitastig..Eftir það voru frumurnar þvegnar tvisvar með PBS, skafaðar og endurleysaðar í ísköldum PBS jafna sem innihélt EDTA-fría próteasahemla (MCE, #HY-K0011).Frumur voru ljósaðar með því að hljóðblanda oddinn í 1 mínútu (1 sekúnda kveikt og 1 sekúnda slökkt við 35% amplitude).Blandan sem myndaðist var skilin í skilvindu við 15.871 xg í 10 mínútur við 4°C til að fjarlægja rusl og styrkur flotans var stilltur á 4 mg/ml með því að nota BCA próteinprófunarbúnað (Beyotime, #P0009).Sameina 1 ml af ofangreindu lýsati með 0,1 mM ljósbrjótanlegu bíótínasíði (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA bindil (Aladdin, #T162437), og 1 mM CuSO4 útungunarvél snúningur upp í 1 klukkustund við stofuhita.Eftir skyndihvarf skal bæta blöndunni við forblönduðu lausnina (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) í 10 ml hettuglasi úr gleri.Sýnunum var blandað saman og skilið í skilvindu við 4500 g í 10 mínútur við stofuhita.Neðri og efri lausninni var hent, botnfallið var þvegið tvisvar með 1 ml af metanóli og skilið í skilvindu við 15871×g í 5 mínútur við 4°C.Bætið 1 ml af 8 M þvagefni (Aladdin, nr. U111902) í 25 mM ammóníumbíkarbónati (ABC, Aladdin, nr. A110539) til að leysa upp botnfallið.Sýni voru blönduð með 10 mM díþíótrítóli (Sangon, #A100281 í 25 mM ABC) í 40 mínútur við 55°C og síðan bætt við 15 mM fersku joðasetamíði (Sangon, #A600539) við stofuhita í myrkri.Alkýlering innan 30 mínútna..5 mM dítíóþrítóli til viðbótar var bætt við til að stöðva hvarfið.Undirbúið um það bil 100 µl NeutrAvidin agarósa perlur (Thermo, #29202) fyrir hvert sýni með því að þvo þrisvar með 1 ml PBS.Ofangreind próteómlausn var þynnt með 5 ml PBS og ræktuð með forþvegnum NeutrAvidin agarósa perlum í 4 klukkustundir við stofuhita.Perlurnar voru síðan þvegnar 3 sinnum með 5 ml PBS sem innihélt 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 sinnum með 5 ml PBS sem innihélt 1M þvagefni og 3 sinnum með 5 ml ddH2O.Perlurnar voru síðan teknar upp með skilvindu og endursviflausnar í 200 μl af 25 mM ABC sem innihélt 1 M þvagefni, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) og 20 ng/μl trypsín (Promega, #V5280).Trypsínið yfir nótt við 37°C með snúningi.Hvarfið var stöðvað með því að bæta við maurasýru (Thermo, # A117-50) þar til pH náði 2-3.Perlurnar voru þvegnar 3 sinnum með 1 ml af PBS sem innihélt 0,2% SDS, 3 sinnum með 1 ml af PBS sem innihélt 1 M þvagefni og síðan 3 sinnum með 1 ml af eimuðu vatni.Breyttu peptíðin voru losuð með léttri lýsu (365 nm) í 90 mínútur með því að nota 200 μl af 70% MeOH.Eftir skilvindu var flotinu safnað saman.Perlurnar voru síðan þvegnar einu sinni með 100 μl af 70% MeOH og flotinu var safnað saman.Sýni voru þurrkuð í Speedvac lofttæmi þykkni og geymd við -20°C fram að greiningu.
Til að bera kennsl á og magngreina stakt súrefnisbreytt peptíð voru sýni endurleyst í 0,1% maurasýru og 1 μg af peptíðum voru greind með Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massarófsmæli sem búinn var nanó ESI uppsprettu frá Tune og Xcalibur frá hugbúnaði söluaðila 4.3.Sýni voru aðskilin á 75 µm × 15 cm innri pakkaðri háræðasúlu með 3 µm C18 efni (ReproSil-pur, #r13.b9.) og tengd við EASY-nLC 1200 UHPLC kerfi (Thermo).Peptíðin voru aðskilin með línulegri 95 mínútna hallaskiljun frá 8% leysi B í 50% leysi B (A = 0,1% maurasýru í vatni, B = 0,1% maurasýru í 80% asetónítríl), síðan línulega aukið í 98% B mín. á 6 mínútum við flæðihraða 300 nl/mín.Orbitrap Fusion Lumos safnar gögnum til skiptis á milli fullrar MS skönnun og MS2 skönnun eftir gögnum.Sputtering spennan var stillt á 2,1 kV og hitastig jónaflutningsháræða var 320°C.MS litróf (350-2000 m/z) var safnað með upplausninni 120.000, AGC 4 × 105 og hámarksinntakstími 150 ms.10 algengustu marghlaðna forefnin í hverri fullri skönnun voru sundruð með því að nota HCD með eðlilegri árekstraorku upp á 30%, fjórpóla einangrunarglugga upp á 1,6 m/z og upplausnarstillingu 30.000.AGC-markmið fyrir tandemmassagreiningu sem notar 5×104 og hámarksinntakstíma 150 ms.Kvika undantekningin er stillt á 30 sekúndur. Óúthlutaðar jónir eða þær með hleðsluna 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS. Óúthlutaðar jónir eða þær með hleðsluna 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Óúthlutaðar jónir eða jónir með hleðslu 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ótilgreindum jónum eða jónum með hleðslu 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS.
Hrá gögnin eru unnin með FragPipe tölvuvettvangi sem byggir á MSFragger.Massaskekkjur og samsvarandi amínósýrur voru ákvörðuð með opnu leitarreikniriti með forvera massaþol upp á -150 til 500 Da.Breytt peptíð voru síðan auðkennd með því að nota histidínbreytingar með massaaukningu upp á +229,0964 og +247,1069 Da í PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Frumur sem tjá samruna miniSOG genið stöðugt voru plötuðar í 6 cm diska.Þegar ~80% samrennsli var náð voru frumur þvegnar einu sinni með HBSS (Gibco, #14025092), síðan ræktaðar með efnarannsóknum í HBSS í 1 klukkustund við 37°C og lýstar með bláu ljósi.10W LED í 20 mínútur við stofuhita.Til að ákvarða hvaða tegund hvarfgjarnra súrefnistegunda er þátttakandi í PDPL, 0,5 mM C-vítamín (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitól (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 var bætt við frumurnar sem bætiefni.Eftir þvott með köldu PBS voru frumur skafnar, þeim safnað í 1,5 ml skilvinduglös og hljóðbeitt með odd í 1 mín í 200 μl af PBS með 1x próteasahemli án EDTA (1 s og 1 s án, amplitude 35%).Blandan sem myndaðist var skilin í skilvindu við 15.871 × g í 10 mínútur við 4 °C og styrkur flotans var stilltur á 1 mg/ml með því að nota BCA próteinprófunarbúnað.Um það bil 50 µl af ofangreindu lýsati var ræktað með 0,1 mM rhodamine azíði (Aladdin, nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA bindil og 1 mM CuSO4 í 1 klukkustund við stofuhita með snúningi frá botni til topps.Eftir smellahvörfin var útfelling með asetoni framkvæmd með því að bæta 250 μl af forkældu asetoni í sýnin, ræktað við -20°C í 20 mínútur og skilvindu við 6010×g í 10 mínútur við 4°C.Safnaðu kögglinum og sjóðaðu í 50 µl af 1x Laemmli's buffer í 10 mínútur við 95 °C.Sýni voru síðan greind á SDS-PAGE löngum gelum og sýnd með Bio-rad ChemiDoc MP Touch myndgreiningarkerfi með Image Lab Touch hugbúnaði.
Tjáning og hreinsun á raðbrigða miniSOG-6xHis próteini var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst.Í stuttu máli var E. coli BL21(DE3) frumum (TransGen, #CD701-02) umbreytt með pET21a-miniSOG-6xHis og próteintjáning var framkölluð með 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Eftir frumugreiningu voru prótein hreinsuð með Ni-NTA agarósa perlum (MCE, nr. 70666), skilað gegn PBS og geymd við –80°C.
Fyrir mótefnabyggða in vitro nálægðargreiningu á merkimiða, blandaðu 100 μM hreinsuðu miniSOG, 1 mM rannsaka 3 og 1 μg einstofna músamótefni (TransGen, #HT501-01) í PBS í heildarhvarfsrúmmálið 50 μl..Hvarfblandan var geisluð með bláu LED ljósi í 0, 2, 5, 10 og 20 mínútur við stofuhita.Blandan var ræktuð með 0,1 mM bíótín-PEG3-asíði (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA bindil og 1 mM CuSO4 í 1 klst við stofuhita á hristara sem hreyfist upp á við.Eftir skyndihvarf skaltu bæta 4x Laemmli's buffer beint við blönduna og sjóða við 95°C í 10 mín.Sýni voru greind á SDS-PAGE hlaupum og greind með Western blotting með streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Tilbúið peptíð sem inniheldur histidín með C-enda amíðun (LHDALDAK-CONH2) var notað til að greina nærliggjandi peptíð sem byggir á in vitro merkingu.Í þessari greiningu var 100 μM hreinsað miniSOG, 10 mM rannsaka 3 og 2 μg/ml tilbúið peptíð blandað í PBS í heildarhvarfsrúmmáli 50 μl.Hvarfblandan var geisluð með bláu LED ljósi í 1 klukkustund við stofuhita.Einn míkrólítri af sýni var greindur með því að nota LC-MS kerfi (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight massagreiningarmælir með MassLynx litrófsgreiningarhugbúnaði).
HEK293T frumur sem tjá miniSOG samruna genið stöðugt voru sáð í 10 cm diska fyrir línur með mismunandi frumulíffæri (Mito, ER, Nucleus) og 15 cm diska fyrir Parkin-miniSOG og BRD4-miniSOG línur.Þegar ~90% samruna var náð voru frumurnar þvegnar einu sinni með HBSS, síðan ræktaðar með rannsaka 3 í HBSS í 1 klukkustund við 37°C og lýstar með 10 W bláum LED við stofuhita.Til að merkja Parkin án snertingar var 10 µM prótónkarbónýlsýaníðburðarefni m-klórfenýlhýdrasóns CCCP (Solarbio, #C6700) með rannsaka 3 í HBSS bætt við í 1 klukkustund við 37°C.Frumugreining, smellaefnafræði, minnkun og alkýlerunarþrep voru þau sömu og lýst er hér að ofan, nema að 2 mg af lýsati var bætt við og bíótín PEG3 azíð var notað í smelluhvarfið í stað ljósbrjótans bíótínasíðs.Eftir auðgun voru perlurnar þvegnar 3 sinnum með 5 ml af PBS sem innihélt 0,2% SDS, 3 sinnum með 5 ml af PBS sem innihélt 1 M þvagefni og 3 sinnum með 5 ml af PBS.Síðan var 2 µg trypsíni bætt við 300 µl 25 mM ABC sem innihélt 1 M þvagefni til að kljúfa próteinið yfir nótt við 37°C.Hvarfið var stöðvað með því að bæta við maurasýru þar til pH var náð 2-3.Eftir trypsínvæðingu á perlum var peptíðlausnin afsöltuð með því að nota SOLAµ HRP súlu (Thermo, #60209-001) og þurrkuð í Speedvac lofttæmi.Peptíð voru endurleyst upp í 0,1% maurasýru og 500 ng af peptíðum voru greind með því að nota Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massarófsmæli með nanó-ESI uppsprettunni sem lýst er hér að ofan.Peptíð voru aðskilin á auglýsingum RP-HPLC forsúlum (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr. 164946) og greiningar RP-HPLC súlum (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr. 164941), báðar fylltar með 2 μm.halli úr 8% í 35% ACN á 60 mínútum, síðan línulega aukinn í 98% B á 6 mínútum við flæðihraða 300 Nl/mín.MS litróf (350-1500 m/z) var safnað með 60.000 upplausn, AGC 4 × 105 og hámarks inntakstíma 50 ms.Valdar jónir voru sundurliðaðar í röð með HCD í 3 sek. lotum með eðlilegri árekstraorku upp á 30%, fjórpóla einangrunarglugga 1,6 m/z og upplausn 15000. 5 × 104 tandem massarófsmælir AGC markmið og hámarks inndælingartíma af 22 ms voru notuð.Kraftmikil útilokun er stillt á 45 sekúndur. Óúthlutaðar jónir eða þær með hleðsluna 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS. Óúthlutaðar jónir eða þær með hleðsluna 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Óúthlutaðar jónir eða jónir með hleðslu 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ótilgreindum jónum eða jónum með hleðslu 1+ og >7+ var hafnað fyrir MS/MS.
Undirbúningsþrep sýna fram að auðgun NeutrAvidin perlna voru þau sömu og í LC-MS/MS greiningunni sem lýst er hér að ofan.Um það bil 50 μg af lýsati voru notuð sem inntak fyrir hleðslustýringu og 2 mg af lýsati voru notuð fyrir smellahvörf.Eftir auðgun og þvott með neutravidíni voru bundnu próteinin skoluð út með því að bæta 50 μl af Laemmli's buffer við agarose resin perlurnar og sjóða við 95°C í 5 mínútur.Viðmiðunarálagsinntak og perluauðguð sýni voru greind með SDS-PAGE og flutt yfir á PVDF himnur (Millipore, #ISEQ00010) með stöðluðum Western blot aðferðum.Himnurnar voru stíflaðar með 5% undanrennu (Sangon, #A600669) í TBS sem innihélt 0,1% tween-20 (TBST) og ræktaðar í röð með frum- og aukamótefnum.Aðalmótefni voru þynnt 1:1000 í 5% undanrennu í TBST og ræktuð yfir nótt við 4°C.Auka mótefni voru notuð í hlutfallinu 1:5000 og ræktuð í 1 klukkustund við stofuhita.Himnurnar voru sýndar með efnaljómun með því að nota Chemidoc MP myndgreiningarkerfið.Allar óklipptar skannanir af blettum og hlaupum á myndinni eru sýndar sem hrá gögn.
Aðal mótefni sem notuð voru í þessari rannsókn voru meðal annars kanínur and-SFPQ einstofna mótefni (CST, nr. 71992), kanínu and-FUS einstofna mótefni (CST, nr. 67840), kanínu and-NSUN2 fjölstofna mótefni (Proteintech, nr. 20854-1) AP), kanínu and-mSin3A fjölstofna mótefni (Abcam, #ab3479), einstofna mótefni gegn músum (TransGen, #HT201-02), einstofna mótefni músa gegn β-aktín (TransGen, #HC201-01), kanínumótefni -CDK2 einstofna mótefni (ABclonal, #A0094), kanína einstofna mótefni gegn CTBP1 (ABclonal, #A11600), kanínu fjölstofna mótefni gegn DUT (ABclonal, #A2901), kanína fjölstofna mótefni gegn PS54, #ABr0nbital- DNAJB1 fjölstofna mótefni (ABclonal, # A5504).Þessi mótefni voru notuð í 1:1000 þynningu í 5% undanrennu í TBST.Auka mótefnin sem notuð voru í þessari rannsókn voru meðal annars IgG gegn kanínu (TransGen, #HS101-01), IgG gegn músum (TransGen, #HS201-01) í 1:5000 þynningu.
Til að kanna frekar hvort BRD4 hafi samskipti við SFPQ voru stöðugar HEK293T og BRD4-miniSOG frumur sem oftjáðu HEK293T settar í 10 cm diska.Frumur voru þvegnar með köldu PBS og ljósaðar í 1 ml Pierce IP lýsisbuffi (Thermo Fisher, #87787) með EDTA-fríum próteasahemli í 30 mínútur við 4°C.Eftir það var lýsunum safnað í 1,5 ml skilvinduglös og skilið í skilvindu við 15.871 xg í 10 mínútur við 4°C.Flotið var safnað og ræktað með 5 µg af and-V5 merktu músa einstofna mótefni (CST, #80076) yfir nótt við 4°C.Þvoið um það bil 50 µl af prótein A/G segulperlum (MCE, #HY-K0202) tvisvar með PBS sem inniheldur 0,5% Tween-20.Síðan voru frumulýsin ræktuð með segulperlum í 4 klukkustundir við 4°C með snúningi frá botni til topps.Síðan voru perlurnar þvegnar fjórum sinnum með 1 ml af PBST jafnalausn og soðnar við 95°C í 5 mín.Sýni voru greind á SDS-PAGE hlaupum og flutt yfir á PVDF himnur með stöðluðum Western blot aðferðum.Himnurnar voru stíflaðar í 5% undanrennu í TBST og ræktaðar í röð með frum- og aukamótefnum.Aðalmótefni Kanínu and-SFPQ einstofna mótefni (CST, #71992) var notað í hlutfallinu 1:1000 í 5% undanrennu í TBST og ræktað yfir nótt við 4°C.Anti-kanínu IgG var notað í hlutfallinu 1:5000 og ræktað í 1 klukkustund við stofuhita.Himnurnar voru sýndar með efnaljómun með því að nota Chemidoc MP myndgreiningarkerfið.
Öll mannvirki sem notuð voru fyrir leysisaðgengilegt yfirborðssvæði (SASA) greiningu voru fengin úr próteingagnabankanum (PDB)52 eða AlphaFold próteinuppbyggingargagnagrunninum53.Alger SASA var reiknuð út fyrir hverja leif með FreeSASA forritinu.Aðeins fullkomin og ótvíræð SASA gögn fyrir merkt histidín og nágranna þess voru notuð til að fá meðaltal SASA fyrir hverja byggingu.Hlutfallslegt leysisaðgengi (RSA) fyrir hvert histidín var reiknað út með því að deila algeru SASA gildinu með reynslufræðilegu hámarks mögulegu yfirborðsflatarmáli leifar sem leysirinn hefur tiltækt.Öll histidín voru síðan flokkuð sem falin ef meðaltal RSA var undir 20%, annars útsett56.
Leitað var í hráum skrám sem fengust í DDA ham með því að nota Proteome Discoverer (v2.5) eða MSfragger (Fragpipe v15.0) í viðeigandi SwissProt sannprófuðum próteingagnagrunni sem inniheldur algengar aðskotaefni.Peptíðin kröfðust algjörs trypsíns með tveimur klofningsstöðum sem vantaði, karbamóýl metýleringu sem fasta breytingu og metíónínoxun sem kraftmikla breytingu.Þyngdarþol undanfara og brota var stillt á 10 ppm og 0,02 Da (MS2 Orbitrap), í sömu röð. Aðskotahlutir voru fjarlægðir og prótein síuð til að fá falska uppgötvun sem var <1%. Aðskotahlutir voru fjarlægðir og prótein síuð til að fá falska uppgötvun sem var <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфиление <1%. Aðskotahlutir voru fjarlægðir og prótein síuð til að gefa falska greiningartíðni <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а bелки отфильтрованы for достижения уровня ложных <1%. Aðskotahlutir voru fjarlægðir og prótein síuð til að ná fram falsku jákvæðu hlutfalli upp á <1%.Fyrir magngreiningu án þess að nota merkingar var notað staðlað próteininnihald frá þremur líffræðilegum endurteknum.Staðsetningargreining próteina undirfrumu var framkvæmd með því að nota Gene Ontology (GO) greiningu frá DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 og gagnagrunna sem Alice Ting hópurinn tók saman og gaf út.Eldfjallakortið var fengið frá Perseifi (v1.6.15.0). Próteinmagnsbreytingar voru prófaðar með tilliti til tölfræðilegrar marktektar með tvíhliða t-prófi og próteinhits greindust með magnbreytingu >2 (nema annað sé tekið fram) og p gildi <0,05. Próteinmagnsbreytingar voru prófaðar með tilliti til tölfræðilegrar marktektar með tvíhliða t-prófi og próteinhits greindust með magnbreytingu >2 (nema annað sé tekið fram) og p gildi <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Breytingar á próteininnihaldi voru prófaðar með tilliti til tölfræðilegrar marktektar með því að nota tvíhliða t-próf ​​og próteinsamsvörun var auðkennd með innihaldsbreytingu >2 (nema annað sé tekið fram) og ap gildi <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Tölfræðileg þýðing faltbreytinga á próteininnihaldi var prófuð með tvíhliða t-prófi og próteinsamsvörun var ákvörðuð fyrir innihaldsbreytingar >2 (nema annað sé tekið fram) og p-gildi <0,05.Próteinvíxlverkunargreining var framkvæmd með því að nota GO greiningu ásamt String gagnagrunninum.
Þrjár líffræðilegar endurtekningar voru gerðar með svipuðum niðurstöðum.Tölfræðileg greining var gerð með GraphPad Prism (GraphPad hugbúnaði) og eldfjallareitir voru búnir til með Perseus (v1.6.15.0).Til að bera saman hópana tvo voru p-gildi ákvörðuð með því að nota tvíhliða t-próf ​​nemenda.Einungis einsleit prótein sem auðkennd voru að minnsta kosti tvisvar í tilraunahópnum voru tekin með í eldfjallatöflunum og samsvarandi gildum sem vantaði í samanburðarhópnum var skipt út fyrir Perseus úr normaldreifingu svo hægt væri að reikna út p-gildið.Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.Í próteingreiningum til tölfræðilegrar greiningar hélst magn próteina sem komu fram í að minnsta kosti tveimur líffræðilegum afritunum.Tölfræðilegar aðferðir voru ekki notaðar til að fyrirframákveða úrtaksstærð.Tilraunirnar eru ekki tilviljunarkenndar.Rannsakendur voru ekki blindir á verkefnin meðan á tilrauninni stóð og mat á niðurstöðum.
Fyrir frekari upplýsingar um hönnun náms, sjá ágrip náttúrurannsóknaskýrslu sem tengist þessari grein.
Massagreiningargögnin sem fengust í þessari rannsókn voru send til ProteomeXchange Consortium í gegnum iProX57 samstarfsgeymsluna undir gagnasafnakenni PXD034811 (PDPL-MS gagnapakka).Hrágögn eru veitt í formi hrágagnaskráa.Þessi grein veitir upprunalegu gögnin.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Að kynnast hverfinu: nota nálægðarháða líftínýleringu til að einkenna próteinfléttur og kortleggja frumulíffæri. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Að kynnast hverfinu: nota nálægðarháða líftínýleringu til að einkenna próteinfléttur og kortleggja frumulíffæri.Gingras, AS, Abe, KT og Raut, B. Þekking á umhverfi: Notkun nálægðarháðrar lífrænnar efnaskipta til að einkenna próteinfléttur og kortleggja frumulíffæri. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Að skilja hverfið: notaðu það hversu háð hverfið er líffræðilegt líf.Gingras, AS, Abe, KT og Raut, B. Skilningur á nálægð: lýsing á próteinfléttum og kortlagningu líffæra með því að nota nálægðarháða bíótínýleringu.Núverandi.Mín skoðun.Efni.líffræði 48, 44–54 (2019).
Geri, JB o.fl.Kortleggja örumhverfið með því að flytja Dexter orku til ónæmisfrumna.Vísindi 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL o.fl.Tveggja próteómkvarðanet greina frumusértæka endurgerð mannlegs samskipta.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).