Hefðbundnar greiningaraðferðir til að greina smitsjúkdóma krefjast notkunar á tækjabúnaði sem hentar ekki fyrir umönnunarpróf (POCT).Emerging microfluidics er mjög smækkuð, sjálfvirk og samþætt tækni sem er hugsanlegur valkostur við hefðbundnar aðferðir fyrir hraðvirka, ódýra, nákvæma greiningu á staðnum.Sameindagreiningaraðferðir eru mikið notaðar í örflæðistækjum sem áhrifaríkustu aðferðirnar til að greina sýkla.Þessi úttekt tekur saman nýlegar framfarir í sameindagreiningum smitsjúkdóma sem byggir á örvökva, bæði frá fræðilegu og iðnaðarlegu sjónarhorni.Í fyrsta lagi lýsum við dæmigerðri vinnslu kjarnsýra á flís, þar með talið formeðferð sýna, mögnun og merkjalestur.Eiginleikar, kostir og gallar hinna fjögurra tegunda örflæðispalla eru síðan bornir saman.Næst munum við fjalla um notkun stafrænna greininga fyrir algera magngreiningu kjarnsýra.Bæði klassísk og nýleg örvökva-undirstaða sameindagreiningartæki eru tekin saman sem sönnunargögn um núverandi stöðu markaðarins.Að lokum leggjum við til framtíðarleiðbeiningar fyrir örvökvagreiningu smitsjúkdóma.
Smitsjúkdómar eru af völdum sýkla, þar á meðal baktería, vírusa og sníkjudýra, sem dreifast um allan heim.Ólíkt öðrum sjúkdómum smitast sýklar fljótt og dreifast á milli manna og hýsildýra með sáningu, lofti og vatni [1].Forvarnir gegn smitsjúkdómum eru mikilvægar sem lýðheilsuráðstöfun.Þrjár meginaðferðir til að berjast gegn smitsjúkdómum: (1) stjórna uppsprettu sýkingar;(2) truflun á flutningsleiðinni;(3) verndun næmra stofna.Meðal helstu aðferða er eftirlit með upptökum sýkingar talin mikilvægasta aðferðin vegna þæginda og lágs kostnaðar.Hröð greining, einangrun og meðferð sýktra einstaklinga eru mikilvæg, krefjast skjótra, viðkvæmra og nákvæmra greiningaraðferða [2].Núverandi greining smitsjúkdóma sameinar venjulega klíníska skoðun byggða á einkennum og rannsóknarstofurannsóknum eins og frumuræktun og sameindagreiningum, sem krefjast þjálfaðs starfsfólks, vinnufrekra aðgerða og dýrs prófunarbúnaðar [3, 4].Forvarnir gegn uppkomu smitsjúkdóma krefjast hraðrar, ódýrrar og nákvæmrar staðbundinnar greiningar, sérstaklega á auðlindamörkuðum svæðum þar sem smitsjúkdómar eru algengir og alvarlegir [5], sem og meðferð í óbyggðum eða á vígvellinum, þar sem neyðarástand er ófyrirsjáanlegt..læknishjálp er takmörkuð [6].Í þessu samhengi er örvökvi tækni sem sameinar örrafmagníska kerfistækni, nanótækni eða efnisfræði fyrir nákvæma vökvameðferð [7,8,9,10], sem gefur nýja möguleika fyrir skynjunarpunkt (POCT).) smitefni utan sjúkrahúsa og rannsóknarstofa.Í samanburði við hefðbundna tímafreka greiningar, býður örvökvatækni upp á sýnishorn og kostnaðarsparnað fyrir sameindagreiningu meðan á sjúkdómsbrotum stendur.Alheimsútbreiðsla kransæðaveirusjúkdómsins 2019 (COVID-19) stafar af alvarlegu bráðu öndunarfæraheilkenni coronavirus 2 (SARS-CoV-2), þannig að mikilvægi örvökva fyrir tímanlega forvarnir og stjórn á heimsfaraldri er aftur áréttað [11, 12 , 13].Ólíkt hefðbundinni greiningu notar microfluidic POCT lítil flytjanleg tæki, allt frá bekkjargreiningartækjum til lítilla hliðarprófunarstrimla til að prófa nálægt sýnatökustaðnum [14].Þessar prófanir eru með einföldum eða engum sýnishornsundirbúningi, hröðum merkjamögnun og viðkvæmum merkjalestri sem leiða til skamms tíma og nákvæmra niðurstaðna innan nokkurra mínútna.Aðgengi og fjöldaframleiðsla á örvökva-undirstaða heilsugæslutækja hefur aukið hagkvæma og beina greiningarnotkun þeirra utan sjúkrahússins, nálægt sjúklingnum og jafnvel heima.
Meðal núverandi aðferða til að greina smitsjúkdóma er sameindagreining ein sú viðkvæmasta [15, 16].Að auki er sameindagreining oft notuð sem gullstaðall fyrir samfellda greiningu á COVID-19, sem gerir beina greiningu á veirusértækum svæðum RNA eða DNA áður en ónæmissvörun hefst [17, 18].Í núverandi endurskoðun kynnum við nýjustu framfarir í örvökva-undirstaða sameindagreiningarferla fyrir smitsjúkdóma, frá fræðilegu sjónarhorni til framtíðar iðnaðarsjónarmiða (mynd 1).Byrjað verður á þremur lykilskrefum í kjarnsýrugreiningu: formeðferð á sýnishorni, kjarnsýrumögnun og merkjalestur.Við bárum síðan saman mismunandi gerðir af örvökvapöllum við uppbyggingu þeirra og virkni og sýndum einstaka eiginleika (styrkleika og veikleika).Stafræn kjarnsýrugreining er frekar rædd og gefin sem dæmi um þriðju kynslóðar tækni fyrir algera magngreiningu smitandi sjúkdómsvalda sameinda.Að auki verða nokkur dæmigerð og nýjustu POCT tæki í atvinnuskyni kynnt til að sýna fram á núverandi stöðu á örflæði POCT markaði fyrir sameindagreiningar.Við munum einnig ræða og útskýra framtíðarsýn okkar fyrir umsóknir í framtíðinni.
Einingum af örvökvaflögum til að greina kjarnsýrur má skipta í þrjá flokka (sýnatöku, auðkenning og merkjagjöf) í samræmi við hlutverk þeirra [19].Meðal þessara eininga gerir sýnatökueiningin sér aðallega grein fyrir sýnisleysi og kjarnsýruútdrátt.Skynjarareiningin stjórnar aðallega umbreytingu og mögnun kjarnsýrumerkja.Merkjaeiningin skynjar merkið sem er breytt og unnið með skynjunareiningunni.Byggt á ferlinu við að greina kjarnsýrur á flís, munum við draga saman hina ýmsu flís sem geta gert sér grein fyrir „inntak og úttak“ aðgerðinni.
Fyrsta skrefið í kjarnsýrugreiningu er kjarnsýruútdráttur, þ.e. að einangra markkjarnsýruna frá upprunalega sýninu.Kjarnsýruútdráttur er framkvæmdur til að hreinsa kjarnsýrur úr öðrum sameindamengun, tryggja heilleika frumbyggingar kjarnsýrusameinda og hámarka árangur.Kjarnsýruútdráttur krefst nauðsynlegrar sýnisgreiningar og kjarnsýrufanga, sem gæði og skilvirkni hafa mikil áhrif á rannsóknir og greiningarniðurstöður.Allar lúmskar aukaverkanir við útdrátt geta takmarkað frekari uppgötvun.Til dæmis eru pólýmerasa keðjuverkun (PCR) og lykkjujafnhita mögnun (LAMP) aðferðir hindrað af sumum lífrænum leysum sem eftir eru eins og etanól og ísóprópanól í kjarnsýrueinangrunarhvarfefnum [20].Vökva-vökva útdráttur og fastfasa útdráttur eru vinsælustu aðferðirnar til að einangra kjarnsýrur [21], hins vegar er vökva-vökva útdráttur á flís afar takmarkaður, þar sem hvarfefnin sem notuð eru við vökva-vökva útdrátt valda tæringu á flestum örvökvaflögum .Hér sýnum við útdráttaraðferðir sem byggja á örfylki og berum saman kosti þeirra og galla.
Kísill er hvarfefni sem er samhæft við kjarnsýrur vegna lífsamrýmanleika þess, stöðugleika og auðveldrar breytingar [22].Mikilvægt er, þegar það er breytt með kísil eða öðrum efnum, sýnir þetta samsetta efni eiginleika til að gleypa neikvætt hlaðnar kjarnsýrur við lágt pH, hátt saltskilyrði á meðan það er skolað með háu pH, lágum saltlausnum.Byggt á þessu fyrirbæri er hægt að hreinsa kjarnsýruna.
Ýmsar gerðir kísilefna hafa verið notaðar til kjarnsýruútdráttar í örvökva, svo sem kísilperlur, duft, örtrefjasíur og kísilhimnur [23, 24, 25, 26].Það fer eftir eiginleikum efnisins og hægt er að nota kísil-undirstaða efni í örrásir á mismunandi hátt.Til dæmis er einfaldlega hægt að setja kísilkorn, duft og nanósíur í atvinnuskyni í svitaholur eða örrásir örfljóta og hjálpa til við að draga kjarnsýrur úr sýnum [27, 28, 29].Einnig er hægt að nota yfirborðsbreyttar kísilhimnur til að hreinsa DNA hratt úr sýkla með litlum tilkostnaði.Til dæmis, Wang o.fl.[30] Með því að sameina eðlismögnunarviðbrögð við blöðrumiðluðum keðjuskiptum við kísilhimnur húðaðar með kítósan fásykrum, var fjölhæft flytjanlegt kerfi kynnt sem greindi með góðum árangri 102–108 nýlendumyndandi einingar.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., og tilvist veirunnar var auðsjáanleg.Powell o.fl.[31] Kísilundirstaða örfylki voru síðan notuð til að greina lifrarbólgu C veiru (HCV), ónæmisbrestsveiru (HIV), Zika veiru og papillomaveiru úr mönnum og sjálfvirk fjölgun, þar sem 1,3 μl hvikull örreactor var þróaður til að fanga RNA veirur.og framkvæma mögnun á staðnum.Auk þessara aðferða gegna yfirborðsbreyttar kísilörsúlur einnig lykilhlutverki í kjarnsýruútdrætti, þar sem rúmfræði og eiginleikar breytiefnisins auka skilvirkni útdráttar til muna.Chen o.fl.[32] lagði til örfljótandi vettvang til einangrunar á lágstyrk RNA byggt á amínóhúðuðum sílikon örsúlum.Þetta örflæðistæki samþættir fylki 0,25 cm2 örsúlna á kísilundirlagi til að ná meiri útdráttarskilvirkni með miklu yfirborðsflatarmáli og rúmmálshönnun.Kosturinn við þessa hönnun er að örvökvabúnaðurinn getur náð allt að 95% skilvirkni kjarnsýruútdráttar.Þessar aðferðir sem byggja á sílikon sýna fram á gildi þess að einangra kjarnsýrur hratt með litlum tilkostnaði.Í samsettri meðferð með örvökvaflögum geta útdráttaraðferðir sem byggjast á sílikon ekki aðeins aukið skilvirkni kjarnsýrugreiningar, heldur einnig auðveldað smæðingu og samþættingu greiningartækja [20].
Segulaðskilnaðaraðferðir nota segulmagnaðir agnir til að einangra kjarnsýrur í nærveru ytra segulsviðs.Algengar segulmagnaðir agnir eru Fe3O4 eða γ-Fe2O3 segulmagnaðir agnir húðaðar með kísil, amínó og karboxýl [33,34,35,36].Sérkenni segulmagnaðir agna samanborið við sílikon-undirstaða SPE aðferðir er auðveld meðhöndlun og stjórn með ytri seglum.
Með því að nota rafstöðueiginleika milli kjarnsýra og kísils, við aðstæður með hátt salt og lágt pH, aðsogast kjarnsýrur á yfirborð kísilhúðaðra segulmagnaðir agna, en við aðstæður með lágt salt og hátt pH er hægt að þvo sameindirnar. aftur..Kísilhúðaðar segulperlur gera það mögulegt að vinna DNA úr sýnum í miklu magni (400 μL) með segulstýrðri hreyfingu [37].Sem sýnikennsla, Rodriguez-Mateos o.fl.[38] notaði stillanlega segla til að stjórna flutningi segulperla í mismunandi hólf.Byggt á kísilhúðuðum segulögnum er hægt að draga 470 eintök/mL af SARS-CoV-2 erfðaefnis-RNA úr afrennslissýnum til LAMP öfugumritunargreiningar (RT-LAMP) og hægt er að lesa svarið innan 1 klukkustundar.berum augum (mynd 2a).
Tæki byggð á segulmagnuðum og gljúpum efnum.Hugmyndafræðileg skýringarmynd af IFAST RT-LAMP örvökvabúnaði fyrir SARS-CoV-2 RNA greiningu (aðlagað frá [38]).b Miðflótta örtæki fyrir dSPE af kjarnsýru úr munnþurrku (aðlagað frá [39]).c Innbyggt sjálfknúið sýnishorn sem notar FTA® kort (aðlagað frá [50]).d Fusion 5 síupappír breytt með kítósani (aðlagað frá [51]).SARS-CoV-2 alvarlegt brátt öndunarfæraheilkenni kransæðaveiru 2, RT-LAMP öfugumritunarlykkju miðluð jafnhita mögnun, FTA finnar tækni samstarfsaðilar, NA kjarnsýra
Jákvætt hlaðnar segulmagnaðir agnir eru tilvalin til að festa fosfatgrunn kjarnsýru.Við ákveðinn saltstyrk geta neikvætt hlaðnir fosfathópar kjarnsýra verið jákvætt hlaðnir á yfirborði segulmagnaðir samsettra agna.Þess vegna voru segulmagnaðar nanóagnir með gróft yfirborð og mikinn þéttleika amínóhópa þróaðar til útdráttar kjarnsýra.Eftir segulmagnaðir aðskilnað og blokkun er hægt að nota segulmagnaðir nanóagnir og DNA-fléttur beint í PCR, sem útilokar þörfina fyrir flóknar og tímafrekar hreinsunar- og skolunaraðgerðir [35].Magnetic nanóagnir húðaðar með neikvæðum karboxýlhópum hafa einnig verið notaðar til að aðskilja kjarnsýrur sem eru aðsogaðar á yfirborð í hástyrk pólýetýlen glýkól og natríumklóríðlausnum [36].Með þessum yfirborðsbreyttu segulmagnaðir perlum er DNA útdráttur samhæfður síðari mögnun.Dignan o.fl.[39] lýsti sjálfvirkum og flytjanlegum miðflótta örvökvavettvangi fyrir kjarnsýruformeðferð, sem gerir ekki tæknimönnum kleift að nota hann á staðnum.Að auki sýnir samhæfni einangraða DNAsins við LAMP, aðferð sem hentar vel fyrir kjarnsýrugreiningu á vettvangi, enn frekar lágmarkskröfur um búnað og hæfi fyrir litamælingar (mynd 2b).
Segulperluaðferðir bjóða upp á möguleika á sjálfvirkum útdrætti, sem sumar eru til í sjálfvirkum kjarnsýruútdráttarvélum í atvinnuskyni [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, Bandaríkjunum), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Kína) og Biomek®;Beckman (Miami, Bandaríkjunum).), Flórída, Bandaríkjunum)].Hægt er að nota kosti þess að sameina segulperlur með örvökva til skilvirkrar sjálfvirkrar útdráttar kjarnsýra, sem gæti hugsanlega ýtt undir þróun sameindagreiningar;samt sem áður, samsetning segulperla með örvökva byggir enn að miklu leyti á flóknum stýrikerfum fyrir nákvæma meðhöndlun á segulperlum, sem útskýrir vinsældir auglýsingavara sem eru fyrirferðarmiklar og dýrar, sem takmarkar frekari beitingu segulperla í POCT.
Nokkur gljúp efni eins og breyttar nítrósellulósasíur, Finders Technology Associates (FTA) kort, pólýetersúlfón byggt síupappír og glýkanhúðuð efni hafa einnig verið notuð til að greina kjarnsýru [40, 41, 42, 43, 44].Gljúp trefjaefni eins og trefjapappír voru fyrst notuð til að einangra DNA með því að flækja langþráðar DNA sameindir líkamlega við trefjar.Lítil svitahola leiða til sterkrar líkamlegrar takmörkunar á DNA sameindum, sem hefur jákvæð áhrif á DNA útdrátt.Vegna mismunandi svitaholastærða á trefjapappír getur útdráttarskilvirkni ekki uppfyllt þarfir DNA mögnunar [45, 46].FTA kortið er viðskiptasíupappír sem notaður er á sviði réttarlækninga og mikið notaður á öðrum sviðum sameindagreiningar.Með því að nota sellulósa síupappír gegndreyptan með ýmsum efnum til að greina frumuhimnurnar í sýninu er losað DNA varið gegn niðurbroti í allt að 2 ár.Nýlega hefur gegndreyptur sellulósapappír verið þróaður til sameindagreiningar á ýmsum sýkla, þar á meðal SARS-CoV-2, leishmaniasis og malaríu [47,48,49].HIV í einangruðu plasma er lýst beint og veirukjarnasýran er auðguð í FTA® flæðishimnu sem er innbyggð í þykkni, sem gerir skilvirka framleiðslu á kjarnsýrunni [50] (Mynd 2c).Helsta vandamálið við kjarnsýrugreiningu með því að nota FTA kort er að efni eins og gúanidín og ísóprópanól hindra síðari mögnunarviðbrögð.Til að leysa þetta vandamál þróuðum við Fusion 5 kítósan-breyttan síupappír, sem sameinar kosti bæði eðlisfræðilegrar fléttunar DNA sameinda og trefjasíupappírs og rafstöðueiginleika ásogs DNA á kítósanbreyttum efnasamböndum til að ná mjög skilvirkri kjarnsýruútdrætti. ..síutrefjar [51] (mynd 2d).Á sama hátt, Zhu o.fl.[52] sýndi kítósan-breytta PCR aðferð sem byggir á háræðsörvökvakerfi á staðnum fyrir hraða einangrun og greiningu á Zika veiru RNA.Kjarnsýrur er hægt að aðsogga/afsogga í blönduðu lýsat/PCR miðli, hver um sig, byggt á kveikja/slökkva rofi eiginleika kítósans.kveikt og slökkt“, bregst við pH.
Eins og getið er hér að ofan sameina þessar aðferðir kosti ýmissa fastfasaefna og auka skilvirkni kjarnsýruútdráttar í örvökva.Í hagnýtri notkun er notkun þessara efna í miklu magni óhagkvæm og rétt yfirborðsmeðferð eða yfirborðsbreyting á algengum efnum með þessum efnum getur einnig varðveitt virkni þeirra.Því er talið að innleiðing þessara aðferða eftir tilraunarannsókn geti dregið úr kostnaði.
Kjarnsýruprófun á örvökvapöllum notar oft lítið sýnismagn (< 100 µl), því krefst mögnunar á markkjarnasýrunum með sérstökum könnunum til að breyta í merki sem er þægilegt fyrir niðurstreymisgreiningu (sjón-, raf- og segulmagnaðir) [53, 54]. Kjarnsýruprófun á örvökvapöllum notar oft lítið sýnismagn (< 100 µl), því krefst mögnunar á markkjarnasýrunum með sérstökum könnunum til að breyta í merki sem er þægilegt fyrir niðurstreymisgreiningu (sjón-, raf- og segulmagnaðir) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Þegar kjarnsýrur eru prófaðar á örvökvapöllum er oft notað lítið sýnisrúmmál (<100 µL), þannig að mögnun markkjarnasýra með sérstökum könnunum er nauðsynleg til að breyta því í merki sem er þægilegt fyrir síðari greiningu (sjón-, raf- og segulmagnaðir) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 转换 为 便于 下游 检测 （光学 电学 和 磁学 磁学） 的 信号 信号 信号 信号 因此 需要 光学 光学 、 电学 和 磁学 的 信号 信号 因此 光学 （（ ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 磁学 磁学） 信号 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Greining kjarnsýra á örvökvapöllum notar venjulega lítið magn sýnishorna (<100 μl), sem krefst mögnunar á markkjarnsýrum með sérstökum könnunum til að breyta þeim í merki fyrir síðari greiningu (sjón-, raf- og segulmagnaðir) [53, 54]] .Kjarnsýrumögnun í örvökva getur einnig flýtt fyrir viðbrögðum, fínstillt greiningarmörk, dregið úr sýnisþörfum og bætt greiningarnákvæmni [55, 56].Á undanförnum árum, með hraðvirkri og nákvæmri uppgötvun, hafa ýmsar kjarnsýrumögnunaraðferðir verið beittar í örvökva, þar á meðal PCR og sum ísóvarma mögnunarviðbrögð.Í þessum hluta verða teknar saman aðferðir við kjarnsýrugreiningu byggðar á örvökvakerfum.
PCR er eftirlíking af DNA eftirmyndunarferli lífveru, kenningunni um hana er lýst ítarlega annars staðar og verður ekki fjallað um hana hér.PCR getur magnað mjög lítið magn af mark-DNA/RNA á veldishraða, sem gerir PCR að öflugu tæki til að greina kjarnsýrur hratt.Á undanförnum áratugum hafa mörg flytjanleg örvökvatæki búin PCR hitauppstreymi kerfum verið þróuð til að mæta þörfum greiningar á vettvangi [57, 58].On-chip PCR má skipta í fjórar gerðir (hefðbundið, stöðugt flæði, staðbundið og convective PCR) samkvæmt mismunandi hitastýringaraðferðum [59].Til dæmis, Gee o.fl.[60] þróuðu bein öfug umritun magn PCR (RT-qPCR) aðferð á eigin örflæðisvettvangi fyrir margfeldisgreiningu SARS-CoV-2, inflúensu A og B veira í hálsþurrkunarsýnum (mynd 3a).Park o.fl.[61] byggði einfaldan sýklagreiningarflögu með því að samþætta þunnfilmu PCR, rafskaut og fingurstýrða pólýdímetýlsíloxan-undirstaða örflæðiseining.Hins vegar fela bæði verkin í sér algenga galla hefðbundins PCR.PCR krefst hitauppstreymis, sem takmarkar frekari smæðun tækisins og styttri prófunartíma.
Þróun á samfelldu flæði byggt örflæði og geimskipt PCR er mikilvæg til að takast á við þetta vandamál.Með því að nota langa serpentínrás eða stutta beina rás getur PCR með stöðugu flæði veitt hraðvirka mögnun með virkri hringrás hvarfefna á þremur forhitunarsvæðum með off-chip dælu.Með þessari aðgerð er tekist að forðast umskiptafasa á milli mismunandi hvarfhita og minnkar þannig prófunartímann verulega [62] (Mynd 3b).Í annarri rannsókn Jung o.fl.[63] lagði til nýjan snúnings PCR erfðagreiningartæki sem sameinar eiginleika fastra og flæðis PCR fyrir ofurhraða og margfalda öfuga umritun PCR (mynd 3c).Fyrir kjarnsýrumögnun verður PCR örflögunni snúið í gegnum þrjá upphitunarkubba við mismunandi hitastig: 1. Denaturation blokk 94°C, 2. Hreinsunarblokk við 58°C, 3. Þenslublokk við 72°C.
Notkun PCR í örvökva.Skýringarmynd af dirRT-qPCR á örflæðisvettvangi (aðlagað frá [60]).b Skýringarmynd af PCR örfylki með stöðugu flæði byggt á serpentínurás (aðlagað frá [62]).c Skýringarmynd af snúnings PCR erfðagreiningartæki, sem samanstendur af örflögu, þremur hitakubbum og þrepamótor (aðlagaður frá [63]).d Skýringarmynd af varmaconvection PCR með skilvindu og uppsetningu (aðlagað frá [64]).DirRT-qPCR, bein magn öfug umritun pólýmerasa keðjuverkun
Með því að nota háræðar og lykkjur eða jafnvel þunnar plötur, getur convection PCR magnað upp kjarnsýrur hratt með náttúrulegri ókeypis varma convection án þess að þörf sé á ytri dælu.Til dæmis var hringlaga olefin fjölliða örflæðisvettvangur þróaður á tilbúnu snúningshitunarstigi sem notar hitauppstreymi með skilvindu í PCR lykkju örrás [64] (Mynd 3d).Hvarflausnin er knúin áfram af hitauppstreymi, sem skiptist stöðugt á háum og lágum hita í örrás með hringlaga uppbyggingu.Hægt er að ljúka öllu mögnunarferlinu á 10 mínútum með greiningarmörkum 70,5 pg/rás.
Eins og við var að búast er hraður PCR öflugt tæki fyrir fullkomlega samþætt sameindagreiningar- og multiplexgreiningarkerfi fyrir sýnissvörun.Hröð PCR dregur verulega úr þeim tíma sem þarf til að greina SARS-CoV-2, sem stuðlar að skilvirkri stjórn á COVID-19 heimsfaraldrinum.
PCR krefst flókins varma hringrás sem hentar ekki fyrir POCT.Nýlega hefur jafnhita mögnunaraðferðum verið beitt á örvökva, þar á meðal en ekki takmarkað við LAMP, recombinasa pólýmerasa mögnun (RPA) og mögnun byggð á kjarnsýruröðum [65,66,67,68].Með þessum aðferðum eru kjarnsýrur magnaðar við stöðugt hitastig, sem auðveldar sköpun ódýrra, mjög viðkvæmra, flytjanlegra POCT-tækja til sameindagreiningar.
LAMP mælingar sem byggja á örvökva með miklum afköstum leyfa margþætta greiningu smitsjúkdóma [42, 69, 70, 71].Í samsetningu með miðflótta örvökvakerfi getur LAMP auðveldað enn frekar sjálfvirkni kjarnsýrugreiningar [69, 72, 73, 74, 75].The Spin-and-react SlipChip var þróað til að greina margar samhliða bakteríur með því að nota LAMP [76] (mynd 4a).Þegar hámarks LAMP var notað í prófuninni var flúrljómunarmerkja- og hávaðahlutfallið um það bil 5-falt og greiningarmörkin náðu 7,2 eintökum/μl af erfðafræðilegu DNA. Ennfremur voru fimm algengir meltingarbakteríur, þar á meðal Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, sýndir á < 60 mín. Ennfremur voru fimm algengir meltingarbakteríur, þar á meðal Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, sýndir á < 60 mín.Ennfremur var tilvist fimm algengra bakteríusýkla í meltingarveginum, þar á meðal Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, sýnd með þessari aðferð á innan við 60 mínútum.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 ， ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 、 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌 弧菌。。。。。。。。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 ， ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPAð auki var tilvist fimm algengra bakteríusýkla í meltingarvegi, þar á meðal Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius og Vibrio parahaemolyticus, sýnd með þessari aðferð á innan við 60 mínútum.
Kostir LAMP í örvökva eru meðal annars hröð svörun og smækkuð uppgötvun.Hins vegar, vegna hvarfhitastigsins (um 70°C), myndast úðabrúsar óhjákvæmilega við LAMP, sem leiðir til mikillar falskur jákvæður hlutfall.Einnig þarf að fínstilla greiningarsérhæfni, grunnhönnun og hitastýringu fyrir LAMP.Að auki er flísahönnun sem innleiðir margar markagreiningu á einni flís mikils virði og ætti að þróa.Að auki hentar LAMP fyrir fjölnota uppgötvun samþætt í einni flís, sem skiptir miklu máli, en það er enn mikið pláss fyrir þróun.
Hátt rangt jákvætt hlutfall LAMP má að hluta til minnka með RPA, þar sem tiltölulega lágt hvarfhitastig (~37 °C) leiðir til tiltölulega fárra uppgufunarvandamála [77].Í RPA kerfinu koma tveir andstæðir primers af stað DNA myndun með því að bindast við recombinasa og mögnun er hægt að ljúka innan 10 mínútna [78,79,80,81].Þess vegna er allt RPA ferlið miklu hraðar en PCR eða LAMP.Á undanförnum árum hefur verið sýnt fram á að örflæðistækni bætir enn frekar hraða og nákvæmni RPA [82,83,84].Til dæmis, Liu o.fl.[85] þróaði örflæðissamþætta hliðflæðis pólýmerasa recombinasa mögnunarpróf fyrir hraða og viðkvæma uppgötvun á SARS-CoV-2 með því að samþætta öfuga umritun RPA (RT-RPA) og alhliða prófunarstrimlaprófunarkerfi fyrir hliðarflæði.inn í eitt örvökvakerfi.mynd 4b).Greiningarmörk eru 1 eintak/µl eða 30 eintök/sýni og hægt er að ljúka greiningu á um 30 mínútum.Kong o.fl.hafa þróað klæðanlegan örflæðisbúnað.[86] notaði líkamshita og flúrljómunargreiningarkerfi sem byggir á farsíma til að greina HIV-1 DNA hratt og beint með því að nota RPA (Mynd 4c).The wearable RPA próf greinir 100 eintök/ml af markröðinni innan 24 mínútna, sem sýnir mikla möguleika á hraðri greiningu á HIV-1 sýktum ungbörnum við takmarkaðar aðstæður.
Jafnhitamögnun í umhirðuprófun (POCT).Þróun og framleiðsla á snúningi og viðbragðs SlipChip.Eftir plasmasuðu voru efstu og neðstu flögurnar settar saman með setti af hnetum til að mynda lokaflöguna (aðlagað frá [76]).b Skýringarmynd af MI-IF-RPA kerfinu fyrir COVID-19 greiningu (aðlagað frá [85]).c Skýringarmynd af klæðanlegu RPA prófi til að greina HIV-1 DNA hratt (aðlagað frá [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, human immunodeficiency virus HIV, RPA recombinasa pólýmerasa mögnun, LED ljósdíóða, MI-IF-Low-RPA Integrated Micro-Flúterasa Recombinase Polymerase Mögnun
RPA sem byggir á örvökva er í örri þróun, en kostnaður við flísaframleiðslu og efnanotkun er of hár og verður að minnka til að auka framboð þessarar tækni.Að auki getur hið mikla næmi RPA haft áhrif á mögnun ósérhæfðra vara, sérstaklega ef mengun er til staðar.Þessar takmarkanir geta haft áhrif á beitingu RPA í örvökvakerfi og verðskuldað frekari hagræðingu.Einnig er þörf á vel hönnuðum grunni og rannsaka fyrir ýmis markmið til að bæta hagkvæmni RPA-undirstaða örflæðisaðferða í POCT.
Cas13 og Cas12a hafa getu til að kljúfa kjarnsýrur af handahófi og því er hægt að þróa þær sem greiningar- og greiningartæki.Cas13 og Cas12a eru virkjuð við tengingu við mark-DNA eða RNA, í sömu röð.Þegar það hefur verið virkjað byrjar próteinið að kljúfa aðrar nærliggjandi kjarnsýrur, eftir það geta leiðar-RNA sem miða á sýklasértækar kjarnsýrur klofið slökkt flúrljómandi rannsaka og losað flúrljómun.Byggt á þessari kenningu, Kellner o.fl.[87] þróaði Cas13-byggða aðferð [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], og Broughton o.fl.[88] þróaði aðra nálgun byggða á Cas12a [CRISPR Trans Reporter miðar á DNA endonuclease (DTECR)].
Á undanförnum árum hafa komið fram ýmsar aðferðir til að greina kjarnsýrur byggðar á CRISPR [89, 90].Hefðbundnar aðferðir sem byggja á CRISPR eru oft tímafrekar og vinnufrekar vegna margra aðferða, þar á meðal kjarnsýruútdrátt, mögnun og CRISPR greiningu.Útsetning vökva fyrir lofti getur aukið líkurnar á fölskum jákvæðum niðurstöðum.Miðað við ofangreint þarf kerfi sem byggir á CRISPR brýnni hagræðingu.
Loftstýrður örflæðisvettvangur sem getur framkvæmt 24 greiningar samhliða hefur verið þróaður fyrir CRISPR-Cas12a og CRISPR-Cas13a greiningarforrit [91].Kerfið er búið flúrljómunarskynjunarbúnaði sem framhjá kjarnsýrumögnun og greinir sjálfkrafa femtomola DNA og RNA sýni.Chen o.fl.[92] samþætt recombinasa mögnun með CRISPR-Cas12a kerfinu í miðflótta örvökva (mynd 5a).Þessi vinna yfirstígur erfiðleikana við að samþætta þessa tvo ferla vegna þess að Cas12a getur melt boðbera DNA og hindrað mögnunarferlið.Að auki, Chen o.fl.[92] að auki forgeymdi hvarfefnin í miðflótta örvökvastýringu til að ljúka sjálfkrafa öllu ferlinu.Í öðru verki, Silva o.fl.[93] þróaði greiningaraðferð án CRISPR/Cas12a mögnunar og snjallsíma til að greina SARS-CoV-2 (mynd 5b).Þessi prófun, þekkt sem mögnunarlaus kerfi sem byggir á farsíma, inniheldur CRISPR/Cas-háð ensím sem byggir á snjallsímasýn á katalasa-mynduð loftbólumerki í örflæðisrásum.Viðkvæm uppgötvun á minna en 50 eintökum/µl af kjarnsýru án formögnunar, allt ferlið frá inndælingu sýnis til merkjalesturs tekur aðeins 71 mínútu.
Kjarnsýrugreiningaraðferðir byggðar á CRISPR.Miðflótta POCT fyrir samþætta sameindagreiningu byggða á CRISPR (aðlagað frá [92]).b Þróun á CASCADE prófinu fyrir snjallsíma-undirstaða greiningu á SARS-CoV-2 (aðlagað frá [93]).RAA recombinasa mögnun, PAM aðliggjandi protospacer mótíf, CRISPR clustered stuttar palindromic endurtekningar með reglulegu millibili, CASCADE kerfi án farsíma mögnunar með CRISPR/CAS háðum ensímum, 1-etýl-3-[3-dímetýlamínóprópýl]karbódíimíð hýdróklóríð EDC
Sem síðasta skrefið í kjarnsýrugreiningu endurspeglar merkjagreining beint greiningarniðurstöður og er mikilvægur þáttur í þróun skilvirks, viðkvæms og nákvæms POCT.Hægt er að lesa merki með ýmsum aðferðum eins og flúrljómandi, rafefnafræðilegum, litamælingum og segulmælingum.Í þessum kafla lýsum við rökstuðningi fyrir hverri nálgun og berum saman sameindagreiningu smitsjúkdóma í örvökva.
Flúrljómunaraðferðir eru mikið notaðar við POCT greiningu smitsjúkdóma vegna ótrúlegra kosta þeirra, framúrskarandi næmni, litlum tilkostnaði, auðveldri notkun og greiningu á umönnunarstöðum [94, 95].Þessar aðferðir nota merkta flúorfór eins og flúrljómandi litarefni og nanóefni til að búa til greinanlegt merki (flúrljómunaraukning eða slökknun).Þessi niðurstaða bendir til þess að hægt sé að skipta aðferðum sem byggja á flúrljómun í beina flúrljómunarmerkingu, merki-kveikt og merki-slökkt flúrljómun [96].Bein uppgötvun flúrljómunarmerkis notar sérstök flúrljómandi merki til að merkja sérstaka bindla sem mynda ákveðið magn af flúrljómun þegar þeir eru sértækir bundnir við mark.Fyrir merkja-undirstaða flúrljómun uppgötvun, gæði flúrljómun merki er jákvætt tengt við stærð áhuga.Flúrljómunarstyrkur er hverfandi í fjarveru marks og er greinanleg þegar nægilegt magn af marki er til staðar.Aftur á móti er styrkleiki flúrljómunar sem greindur er með „merki-slökkva“ flúrljómun í öfugu hlutfalli við magn marksins, nær upphaflega hámarksgildi og minnkar smám saman eftir því sem markið er stækkað.Til dæmis, með því að nota CRISPR-Cas13a markháða trans-klofunarkerfi, Tian et al.[97] þróaði nýja viðurkenningaraðferð til að greina RNA sem fara framhjá öfugri umritun beint (mynd 6a).Við tengingu við viðbótarmark-RNA er hægt að virkja CRISPR-Cas13-RNA flókið, sem kveikir á milli klofnunar með ósértækum reporter RNA.Flúrljómandi merkti fréttamaðurinn [flúorófór (F)] er slökktur af slökkvibúnaðinum (Q) ósnortinn og flúrljómar þegar hann er klofinn af virkjaða flókinu.
Kosturinn við rafefnafræðilega uppgötvun er mikill skynjunarhraði, auðveld framleiðsla, litlum tilkostnaði, auðvelt að bera og sjálfvirk stjórn.Það er öflug greiningaraðferð fyrir POCT forrit.Byggt á grafen sviði-áhrif smára Gao o.fl.[98] þróaði nanólífskynjara fyrir margfeldisgreiningu á Lyme-sjúkdómsmótefnavökum frá Borrelia burgdorferi bakteríum með greiningarmörkum 2 pg/mL (mynd 6b).
Litamælingar hafa verið notaðar í POCT forritum og notið góðs af kostum flytjanleika, litlum tilkostnaði, auðveldum undirbúningi og sjónrænum lestri.Litamælingargreining getur notað oxun peroxidasa eða peroxidasalíkra nanóefna, samsöfnun nanóefna og viðbót við vísilitarefni til að breyta upplýsingum um nærveru markkjarnasýra í sýnilegar litabreytingar [99, 100, 101].Athyglisvert er að nanóagnir úr gulli eru mikið notaðar við þróun litamælingaaðferða og vegna getu þeirra til að framkalla hraðar og marktækar litabreytingar er aukinn áhugi á þróun POCT litamælingavettvanga fyrir in situ greiningu á smitsjúkdómum [102].Með samþættum miðflótta örvökvabúnaði [103] er hægt að greina matarsýkla í menguðum mjólkursýnum sjálfkrafa á stigi 10 bakteríufrumna og hægt er að lesa niðurstöðurnar sjónrænt innan 65 mínútna (mynd 6c).
Segulskynjunaraðferðir geta greint greiniefni nákvæmlega með segulmagnaðir efni og verulegur áhugi hefur verið á POCT forritum undanfarna áratugi.Segulskynjunartækni hefur nokkra einstaka kosti eins og lággjalda segulmagnaðir efni frekar en dýra sjónhluta.Hins vegar bætir notkun segulsviðs greiningarskilvirkni og dregur úr undirbúningstíma sýna [104].Að auki sýna niðurstöður segulrannsókna mikla sértækni, næmi og hátt merki-til-suð hlutfall vegna óverulegs segulmagnaðs bakgrunnsmerkis lífsýna [105].Sharma o.fl.samþætti lífskynjara sem byggir á segulmagnaðir gangnamótum í færanlegan örflöguvettvang.[106] fyrir margfeldisgreiningu sýkla (mynd 6d).Lífskynjarar greina á næman hátt undirnómólar kjarnsýrur einangraðar frá sýkla.
Dæmigerð merkjaskynjunaraðferð.Hugmyndin um ofstaðbundna uppgötvun á Cas13a (aðlagað frá [97]).b Graphene nanobiosensor FET ásamt Lyme GroES scFv (aðlagað frá [98]).c Litamælingar fyrir margfeldisgreiningu matarsýkla í miðflótta örvökvaflögu: sýni nr. 1 og nr. 3 með marksýkla og nr. 2, nr. 4 og nr. 5 sýni án marksýkla (aðlöguð frá [103]) .d Lífskynjari sem byggir á segulmagnaðir gangnamótum, þar á meðal pallur, innbyggður blokkunarmagnari, stjórneining og aflgjafi fyrir merkjamyndun/öflun (aðlagað frá [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA pólýmetýl metakrýlat
Þrátt fyrir frábæra eiginleika ofangreindra uppgötvunaraðferða hafa þær enn ókosti.Þessar aðferðir eru bornar saman (tafla 1), þar á meðal sum forrit með smáatriðum (kostir og gallar).
Með þróun örvökva, örrafmagnískra kerfa, nanótækni og efnisfræði, er notkun örflæðisflaga til að greina smitsjúkdóma stöðugt fleygt fram [55,96,107,108].Nákvæm meðhöndlun smábúnaðar og vökva stuðlar að greiningarnákvæmni og hagkvæmni.Þess vegna, til frekari þróunar, hefur verið reynt að hagræða og uppfæra flögurnar, sem hefur leitt til ýmissa örflæðisflaga með mismunandi uppbyggingu og virkni.Hér kynnum við stuttlega nokkrar algengar gerðir af örflæðispöllum og berum saman eiginleika þeirra (kostir og gallar).Að auki beinast flest dæmin sem talin eru upp hér að neðan fyrst og fremst á baráttuna gegn SARS-CoV-2.
LOCC eru algengustu smækkuðu flóknu greiningarkerfin og starfsemi þeirra er mjög smækkuð, samþætt, sjálfvirk og samhliða frá inndælingu og undirbúningi sýna, flæðistýringu og vökvagreiningu [109, 110].Vökvar eru meðhöndlaðir með vandlega hönnuðum rúmfræði og víxlverkun margra eðlisfræðilegra áhrifa eins og þrýstingshalla, háræðavirkni, rafaflfræði, segulsviða og hljóðbylgna [111].LOCC sýnir framúrskarandi kosti í skimun með mikilli afköstum og margfeldisgreiningu, með hröðum greiningarhraða, lítilli sýnishornsstærð, lítilli orkunotkun og mikilli stjórnun og rekstrarhagkvæmni;þó, LOCC tæki eru mjög viðkvæm, og framleiðsla, pökkun, og tengi.Hins vegar stendur margföldun og endurnotkun frammi fyrir miklum erfiðleikum [96].Í samanburði við aðra vettvang hefur LOCC einstaka kosti hvað varðar hámarksfjölbreytni notkunar og bestu tæknisamhæfni, en ókostir þess eru líka augljósir, þ.e. mikil flókin og léleg endurtekningarhæfni.Háð ytri dælur, sem oft eru fyrirferðarmiklar og dýrar, takmarkar notkun þeirra enn frekar í POCT.
Meðan á COVID-19 braust, fékk LOCC mikla athygli.Á sama tíma eru nokkrir nýir flísar sem sameina nokkra tækni.Til dæmis eru snjallsímar nú mikið notaðir sem færanleg greiningartæki og hafa mikla möguleika á LOCC samþættingu.Sun o.fl.[21] framleiddi örvökvaflís sem gerir kleift að margfalda sérstakar kjarnsýruraðir fimm sýkla, þar á meðal SARS-CoV-2, með því að nota LAMP og greindi þær með snjallsíma innan 1 klukkustundar eftir lok hvarfsins.Sem annað dæmi, Sundah o.fl.[112] bjó til sameindarofa [hvatamögnun með sameindaskiptistöðurofa (CATCH)] fyrir beina og viðkvæma greiningu á SARS-CoV-2 RNA markmiðum með snjallsímum. CATCH er samhæft við færanlegan LOCC og nær yfirburða afköstum (um það bil 8 RNA eintök/μl; < 1 klst við stofuhita) [112]. CATCH er samhæft við færanlegan LOCC og nær yfirburða afköstum (um það bil 8 RNA eintök/μl; < 1 klst við stofuhita) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНЕНИН/1мкон Ревосходную) CATCH er samhæft við færanlegan LOCC og veitir framúrskarandi afköst (u.þ.b. 8 RNA eintök/µl; < 1 klst við stofuhita) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下< 1 尀温下 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下< 1 尀温下 CATCH совместим с PORTативными LOCC и обладает превосходной производительностью (fyrir 8 einingar РНак/1 превосходной производительностью; CATCH er samhæft við færanlegan LOCC og hefur framúrskarandi afköst (u.þ.b. 8 RNA eintök/µl; < 1 klukkustund við stofuhita) [112].Að auki nota LOCC tæki til sameindagreininga einnig nokkra drifkrafta eins og lofttæmi, teygjur og rafsvið.Kang o.fl.[113] sýndi rauntíma, ofurhraðan nanóplasma-á-flís PCR fyrir skjóta og megindlega greiningu á COVID-19 á sviði með því að nota lofttæmi plasmonic fljótandi PCR flís.Li o.fl.[114] þróaði í kjölfarið teygjudrifinn örvökvaflís sem gerði greiningu á COVID-19 kleift.Pallurinn notar RT-LAMP mögnunarkerfið til að ákvarða hvort sýni sé eigindlega jákvætt eða neikvætt.Í kjölfarið, Ramachandran o.fl.[115] náði viðeigandi rafsviðshalla með því að nota ísótkóforesis (ITP), sértæka jónafókustækni sem er útfærð í örvökva.Með ITP er hægt að hreinsa sjálfkrafa mark-RNA úr hráum nefkoksþurrkusýnum.Síðan Ramachandran o.fl.[115] Með því að sameina þessa ITP-hreinsun með ITP-bættu LAMP- og CRISPR-prófum fannst SARS-CoV-2 í nefkoksþurrku úr mönnum og klínískum sýnum á um það bil 35 mínútum.Auk þess koma stöðugt fram nýjar hugmyndir.Jadhav o.fl.[116] lagði til greiningarkerfi byggt á yfirborðsaukaðri Raman litrófsgreiningu ásamt örflæðisbúnaði sem inniheldur annað hvort lóðrétt stillt gull/silfurhúðuð kolefnis nanórör eða einnota rafspunn ör/nanorör.Himnuvirkaðar innbyggðar síu örrásir eru einnota.Tækið dregur í sig vírusa úr ýmsum líkamsvökvum/blæstri eins og munnvatni, nefkoki og tárum.Þannig er vírustíter nóg og hægt er að bera kennsl á vírusinn nákvæmlega með Raman undirskriftinni.
LOAD er miðflótta örflæðisvettvangur þar sem öllum ferlum er stjórnað af tíðnisamskiptareglum sem snýr örskipuðu undirlagi [110].LOAD tækið einkennist af því að nota miðflóttaafl sem mikilvægan drifkraft.Vökvar eru einnig háðir háræða-, Euler- og Corioliskraftum.Með því að nota miðflóttabúnað eru greiningar framkvæmdar í samfelldri vökvaaðgerð frá geislamyndaðri stöðu inn á við og út, sem útilokar þörfina fyrir viðbótar ytri slöngur, dælur, stýrisbúnað og virka loka.Í stuttu máli, ein stjórnunaraðferð einfaldar aðgerðina.Kraftarnir sem verka á vökvann í sömu örvökvarás í sömu fjarlægð frá álagsmiðju eru jafnir, sem gerir það mögulegt að endurtaka rásarbygginguna.Þannig er LOAD búnaður einfaldari og hagkvæmari í hönnun og framleiðslu en hefðbundinn LOCC búnaður á meðan viðbrögðin eru að mestu óháð og samhliða;Hins vegar, vegna mikils vélræns styrks miðflóttabúnaðar, er tiltækt flísefni takmarkað og lítið magn er erfitt.að bílnum.Á sama tíma eru flest LOAD tæki eingöngu hönnuð fyrir einnota notkun, sem er dýrt fyrir uppgötvun í stórum stíl [96, 117, 118, 119].
Undanfarna áratugi hefur LOAD, sem er talið eitt af efnilegustu örflæðistækjunum, fengið töluverða athygli vísindamanna og framleiðenda.Þannig hefur LOAD öðlast víðtæka viðurkenningu og hefur verið notað til sameindagreininga á smitsjúkdómum [120, 121, 122, 123, 124], sérstaklega á meðan COVID-19 braust út.Til dæmis, í lok árs 2020, Ji o.fl.[60] sýndi beina RT-qPCR prófun fyrir skjóta og sjálfvirka samhliða greiningu á SARS-CoV-2 og inflúensu A og B sýkingum í hálsþurrkunarsýnum.Síðan Xiong o.fl.[74] kynnti LAMP-samþættan diskómyndaða örflæðisvettvang fyrir hraða, nákvæma og samtímis uppgötvun sjö manna öndunarfærakórónuveirra, þar á meðal SARS-CoV-2, innan 40 mínútna.Snemma árs 2021, de Oliveira o.fl.[73] sýndi pólýstýren andlitsvatn miðflótta örvökva flís, handstýrður með fingurgóma snúningi, fyrir RT-LAMP sameindagreiningu á COVID-19.Í kjölfarið hafa Dignan o.fl.[39] kynnti sjálfvirkt flytjanlegt miðflótta örtæki til að hreinsa SARS-CoV-2 RNA beint úr munnþurrkunarhlutum.Medved o.fl.[53] lagði til innbyggt SARS-CoV-2 úðasýnistökukerfi með litlu magni sem snýr örfljótandi flúrljómandi flís með greiningarmörkum 10 eintök/μL og lágmarkslotuþröskuld 15 mínútur.Suarez o.fl.[75] greindi nýlega frá þróun á samþættum miðflótta örvökvavettvangi fyrir beina greiningu á SARS-CoV-2 RNA í hitaóvirkjuð sýni úr nefkoki með LAMP.Þessi dæmi sýna mikinn ávinning og loforð LOAD í sameindagreiningum COVID-19.
Árið 1945 kynntu Muller og Clegg [125] fyrst örvökvarásir á pappír með síupappír og paraffíni.Árið 2007 skapaði Whitesides hópurinn [126] fyrsta hagnýta pappírsvettvanginn fyrir prótein- og glúkósaprófanir.Pappír er orðinn kjörið undirlag fyrir örvökva.Pappírinn hefur eðlislæga eiginleika eins og vatnssækni og gljúpa uppbyggingu, framúrskarandi lífsamrýmanleika, léttan þyngd, sveigjanleika, samanbrjótanleika, litlum tilkostnaði, auðvelda notkun og þægindi.Klassískir µPADs samanstanda af vatnssæknum/vatnsfælnum mannvirkjum byggð á pappírsundirlagi.Það fer eftir þrívíddarbyggingunni, μPAD má skipta í tvívíð (2D) og þrívídd (3D) μPAD.2D µPAD eru framleidd með því að mynda vatnsfælin mörk til að mynda örflæðisrásir, en 3D µPAD eru venjulega gerðar úr bunkum af lögum af 2D örflæðispappír, stundum með pappírsbrjótingu, sleðatækni, opnum rásum og 3D prentun [96].Vatnskenndir eða líffræðilegir vökvar á μPAD eru fyrst og fremst stjórnað af háræðakrafti án utanaðkomandi aflgjafa, sem auðveldar forgeymslu hvarfefna, meðhöndlun sýna og greiningu multiplex.Hins vegar er nákvæm flæðistýring og multiplex uppgötvun hamlað af ófullnægjandi greiningarhraða, næmi og endurnýtanleika [96, 127, 128, 129, 130].
Sem óvenjulegur örflæðisvettvangur hefur μPAD verið víða kynnt og þróað fyrir sameindagreiningu smitsjúkdóma eins og HCV, HIV og SARS-CoV-2 [131, 132].Fyrir sértæka og viðkvæma greiningu á HCV, Tengam o.fl.[133] þróaði nýjan lífskynjara byggðan á flúrljómandi pappír með því að nota mjög sértækan kjarnsýrurannsókn sem byggist á pýrrólidínýl peptíði.Kjarnsýrur eru samgildar óhreyfðar á að hluta oxaðan sellulósapappír með afoxandi alkýleringu milli amínóhópa og aldehýðhópa og greining byggist á flúrljómun.Þessi merki er hægt að lesa með sérgerðri græju með flytjanlegri flúrljósmyndavél ásamt farsímamyndavél.Í kjölfarið, Lu o.fl.[134] hannaði sveigjanlegt rafskaut sem byggir á pappír sem byggir á nikkel/gull nanóögnum/kolefni nanórörum/pólývínýlalkóhóli lífrænum málmum ramma samsettra efna fyrir HIV markagreiningu með DNA blendingu með því að nota metýlen blátt sem DNA redox vísir.Nýlega, Chowdury o.fl.[135] kynnti ímyndaða vettvangshönnun fyrir µPAD próf á umönnunarstað með því að nota hrátt munnvatn sjúklinga ásamt LAMP og flytjanlegri myndgreiningartækni fyrir greiningu COVID-19 greiningarefna.
Hliðflæðisprófanir leiða vökva með háræðskrafti og stjórna hreyfingu vökva með vætanleika og eiginleikum gljúps eða örskipaðs hvarfefna.Hliðflæðistækin samanstanda af sýni, samtengingu, útungunarvél og greiningu, og gleypnum púðum.Kjarnsýrusameindirnar í LFA þekkja sértæk bindiefni sem eru fyrirfram geymd á bindisstaðnum og bindast sem fléttur.Þegar vökvinn fer í gegnum ræktunar- og greiningarplöturnar eru flétturnar fangaðar af fangasameindunum sem eru staðsettar á prófunar- og viðmiðunarlínunum og sýna niðurstöður sem hægt er að lesa beint með berum augum.Venjulega er hægt að klára LFA á 2-15 mínútum, sem er hraðari en hefðbundin uppgötvun.Vegna sérstakra vélbúnaðar krefst LFA fárra aðgerða og krefst ekki viðbótarbúnaðar, sem gerir það mjög notendavænt.Það er auðvelt að framleiða og smæða það og kostnaður við pappírsbundið hvarfefni er lægri.Hins vegar er það aðeins notað til eigindlegrar greiningar og megindleg uppgötvun er mjög erfið og margföldunargetan og afköst eru mjög takmörkuð og aðeins er hægt að greina eina nægjanlega kjarnsýru í einu [96,110,127].
Þrátt fyrir að flest notkun LFA sé lögð áhersla á ónæmismælingar, er notkun LFA til sameindagreiningar í örvökvaflögum einnig áhrifarík og vinsæl [136].Þegar um er að ræða lifrarbólgu B veiru, HIV og SARS-CoV-2 LFA Gong o.fl.[137] lagði til upp-umbreytingu nanóagna LFA vettvang og sýndi fram á fjölhæfni þessa smækkaða og flytjanlega vettvangs með næmri og magnbundinni uppgötvun margra marka eins og HBV kjarnsýru.Að auki, Fu o.fl.[138] sýndi fram á nýtt LFA byggt á yfirborðsaukaðri Raman litrófsgreiningu fyrir megindlega greiningu á HIV-1 DNA við lágan styrk.Fyrir skjóta og viðkvæma greiningu á SARS-CoV-2, Liu o.fl.[85] þróaði örflæðissamþætta RPA hliðflæðisgreiningu með því að sameina RT-RPA og alhliða hliðarflæðisskynjunarkerfi í eitt örflæðiskerfi.
Notkun ýmissa örvökvapalla er mismunandi eftir sérstökum rannsóknum, og nýtir getu og kosti vettvanganna til fulls.Með lokum, dælum og rásum á viðráðanlegu verði, er LOCC umfangsmesti vettvangurinn fyrir fjölbreytileika og samvirkni með mesta þróunarrýmið.Þess vegna vonum við og mælum með því að nýjustu rannsóknirnar verði gerðar á LOCC sem fyrstu tilraun og að aðstæður verði sem bestar.Auk þess er gert ráð fyrir að skilvirkari og nákvæmari aðferðir verði uppgötvaðar og notaðar í kerfinu.LOAD skarar fram úr í nákvæmri stjórn á vökva úr núverandi LOCC tækjum og sýnir einstaka kosti í stökum drifum með miðflóttaafli án þess að þurfa utanaðkomandi drif, en samhliða svörun getur verið aðskilin og samstillt.Þannig mun LOAD í framtíðinni verða aðal örflæðisvettvangurinn með minni handvirkum aðgerðum og þroskaðri og sjálfvirkri tækni.µPAD vettvangurinn sameinar kosti LOCC og pappírsbundinna efna fyrir ódýran einnota greiningu.Þess vegna ætti framtíðarþróun að einbeita sér að þægilegri og rótgróinni tækni.Að auki hentar LFA vel til að greina með berum augum, sem lofar að draga úr sýnaneyslu og flýta fyrir uppgötvun.Ítarlegur samanburður á palli er sýndur í töflu 2.
Stafrænar greiningar skipta sýninu í marga örreactora, sem hver um sig inniheldur stakan fjölda marksameinda [139, 140].Stafrænar prófanir bjóða upp á umtalsverða kosti til að framkvæma algera magngreiningu með því að framkvæma þúsundir samhliða lífefnafræðilegra tilrauna samtímis og hver fyrir sig í hólfum í míkróna mælikvarða frekar en í samfelldum fasa.Í samanburði við hefðbundna örvökva geta hólfaviðbrögð dregið úr sýnisrúmmáli, aukið hvarfvirkni og auðveldlega verið samþætt við aðrar greiningaraðferðir án þess að þörf sé á rásum, dælum, lokum og þéttri hönnun [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Eftirfarandi tvær aðferðir eru notaðar í stafrænum mælingum til að ná einsleitum og nákvæmum aðskilnaði lausna, þar með talið hvarfefni og sýni eins og frumur, kjarnsýrur og aðrar agnir eða sameindir: (1) dropafleyti sem nýta óstöðugleika vökvaskila;(2) fylkisskipting er framkvæmd af rúmfræðilegum takmörkunum tækisins.Í fyrstu aðferðinni er hægt að búa til dropa sem innihalda hvarfefni og sýni í örrásum með óvirkum aðferðum eins og samstraumi, krossflæði, flæðisfókus, þrepaðri fleyti, örrásarfleyti og himnur í gegnum seigfljótandi skurðkrafta og fleyti með rásbreytingum.staðsetning [143, 145, 146, 148, 149] eða með virkum aðferðum [150, 151], sem innleiðir viðbótarorku með raf-, segul-, varma- og vélrænni stjórn.Í síðari nálguninni er besta vökvarúmmál einsleitni í örflæðishólfum deilt með því að halda staðbundnum byggingum af sömu stærð, svo sem örholur og yfirborðsfylkingar [152,153,154].Sérstaklega eru dropar helstu flæðishlutar sem einnig er hægt að búa til og meðhöndla á rafskautafylkingum sem byggjast á stafrænum örflæði (DMF).Rafvötnun rafefna er ein best rannsakaða DMF kenningin, þar sem rafvæting rafefna gerir kleift að meðhöndla einstaka dropa nákvæmlega, stjórna lögun vökvans og ósamhverfa rafboða sem fara í gegnum mismunandi hliðar [141, 144].Helstu aðgerðir með dropa í DMF eru flokkun, skipting og sameining [151, 155, 156], sem hægt er að beita á ýmsum sviðum greiningar, sérstaklega við sameindagreiningu [157, 158, 159].
Stafræn kjarnsýrugreining er þriðju kynslóðar sameindagreiningartækni sem fylgir hefðbundinni PCR og magnbundinni rauntíma PCR (qPCR), samhliða raðgreiningu með miklum afköstum og fljótandi vefjasýni.Á síðustu tveimur áratugum hafa stafrænar kjarnsýrur þróast hratt á sviði sameindagreiningar á smitsjúkdómum [160, 161, 162].Alger magngreining á stafrænni kjarnsýrugreiningu hefst með því að pakka sýnum og hvarfefnum í einstök hólf til að tryggja að hver markröð hafi sömu líkur á að komast inn í hvert einstakt hólf.Fræðilega séð getur hverjum hluta verið úthlutað mörgum markraðir, eða það er ekki hægt að vera sjálfstætt örviðbragðskerfi.Með hinum ýmsu skynjunaraðferðum sem lýst er hér að ofan er hægt að sjá hólf með örverumarkraðir sem mynda merki yfir ákveðnum þröskuldi með berum augum eða með vél og eru merkt sem jákvæð, en önnur hólf sem framleiða merki undir viðmiðunarmörkum eru merkt sem jákvæð .neikvæðar, sem gera merkið fyrir hvern hluta að Booleska.Þannig, með því að reikna út fjölda hólfa sem búið er til og hraða jákvæðra niðurstaðna eftir hvarfið, er hægt að passa saman upprunalegu afritin af prófunarsýnunum með því að nota Poisson dreifingarformúluna án þess að þörf sé á staðlaðri feril, sem er nauðsynleg fyrir hefðbundnar megindlegar greiningar, t.d. sem qPCR.[163] Í samanburði við hefðbundnar sameindagreiningaraðferðir hefur stafræn kjarnsýrugreining meiri sjálfvirkni, meiri greiningarhraða og næmi, færri hvarfefni, minni mengun og einfaldari hönnun og framleiðslu.Af þessum ástæðum hefur notkun stafrænna greininga, sérstaklega dropabundinna aðferða, til sameindagreininga, sem sameinar mögnunar- og merkjaútlestrartækni, verið rannsökuð vel meðan á mikilvægu faraldri SARS-CoV-2 kom.Til dæmis, Yin o.fl.[164] sameinuðu dropastafrænar og hraðvirkar PCR-aðferðir til að greina ORF1ab, N og RNase P genin í SARS-CoV-2 í örflæðisflís.Sérstaklega var kerfið fær um að bera kennsl á jákvætt merki innan 115 sekúndna, sem er hraðari en hefðbundin PCR, sem gefur til kynna virkni þess við greiningu á umönnunarstað (Mynd 7a).Dong o.fl.[165], Sow o.fl.[157], Chen o.fl.[166] og Alteri o.fl.[167] beitti einnig dropastafrænu PCR (ddPCR) til að greina SARS-CoV-2 í örvökvakerfi með glæsilegum árangri.Til að bæta greiningarhlutfallið enn frekar, Shen o.fl.[168] náði ddPCR-undirstaða flísmyndatöku á allt að 15 sekúndum án þess að nota myndasaumatækni, sem flýtti fyrir ddPCR tækniferlinu frá rannsóknarstofu til notkunar.Ekki aðeins er beitt hitamögnunaraðferðum eins og PCR, heldur einnig jafnhitamögnunaraðferðum til að einfalda hvarfaðstæður og skjóta svörun.Lu o.fl.[71] þróaði SlipChip fyrir dropagreiningu, sem er fær um að búa til dropa af ýmsum stærðum við mikinn þéttleika í einu skrefi og mæla SARS-CoV-2 kjarnsýrur með því að nota stafrænt LAMP (Mynd 7b).Sem tækni í örri þróun getur CRISPR einnig gegnt mikilvægu hlutverki í stafrænni kjarnsýrugreiningu með þægilegri litamælingu án þess að þörf sé á frekari kjarnsýrublettum.Ackerman o.fl.þróað samsett fylkishvörf fyrir margfeldismat á kjarnsýrum.[158] greindi 169 vírusa tengda mönnum, þar á meðal SARS-CoV-2, í dropum sem innihéldu CRISPR-Cas13-undirstaða kjarnsýrugreiningarefni í örholugreiningu (Mynd 7c).Að auki er hægt að nota jafnhita mögnun og CRISPR tækni í sama kerfinu til að sameina kosti beggja.Park o.fl.[169] CRISPR/Cas12a stafræn prófun var þróuð í örflögu í atvinnuskyni til að greina útdregið og hitadrepst SARS-CoV-2 byggt á eins þrepa RT-RPA með styttri og hærri merki-til-bakgrunnsgreiningu tímahlutfall., breiðari hreyfisvið og betra næmi (Mynd 7d).Nokkrar lýsingar á þessum dæmum eru gefnar í töflu 3.
Dæmigerður stafrænn vettvangur fyrir kjarnsýrugreiningu.a Hraða stafræna PCR vinnuflæðið samanstendur af fjórum lykilskrefum: sýnis undirbúningi, dreifingu hvarfblöndunnar, mögnunarferli og markmagngreiningu (aðlagað frá [164]).b Skýringarmynd sem sýnir greiningu á SlipChip dropum fyrir dropamyndun við mikinn þéttleika (aðlagað frá [71]).c CARMEN-Cas verkflæðismynd13 (aðlöguð frá [158]).d Yfirlit yfir háþróaða stafræna vírusgreiningu með CRISPR/Cas í einum potti (aðlagað frá [169]).W/O vatn-í-olíu, pólýdímetýlsíloxan PDMS, PCR pólýmerasa keðjuverkun, DAQ gagnasöfnun, PID hlutfallsleg samþætt afleiða, CARMEN samsett fylkisviðbrögð fyrir multiplex kjarnsýrumat, SARS-CoV-2, alvarlegt brátt öndunarfæraheilkenni, kransæðavírus 2, RT mögnun á bakrita recombinasa pólýmerasa-RPA, S/B merki í bakgrunni
Birtingartími: 15. september 2022
